發(fā)布時(shí)間：2020-09-10 20:35

　　 基因組不斷受到來(lái)自?xún)?nèi)外環(huán)境的壓力(如紫外線(xiàn)和電離輻射等)造成DNA損傷。細(xì)胞內(nèi)DNA損傷觸發(fā)細(xì)胞周期檢查點(diǎn)激活,導(dǎo)致細(xì)胞周期進(jìn)程延遲或阻滯,阻止細(xì)胞復(fù)制并且誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行DNA損傷修復(fù)。Clamp 9-1-1復(fù)合體和clamp loader Rad24-RFC在細(xì)胞周期檢查點(diǎn)激活方面起著重要作用。9-1-1復(fù)合體是由Rad9-Hus1-Rad1組成的環(huán)形異源三聚體復(fù)合物,其中Rad9/Ddc1的C端含有大量磷酸化的位點(diǎn)和蛋白相互作用位點(diǎn),包括DNA損傷修復(fù)關(guān)鍵激酶ATR和TopBP1等。但是由于Rad9/Ddc1 C端結(jié)構(gòu)柔性程度高,目前還沒(méi)有9-1-1復(fù)合體的完整結(jié)構(gòu)。解析9-1-1復(fù)合體在不同狀態(tài)下的(包括DNA損傷條件下)完整結(jié)構(gòu),尤其是獲得Rad9/Ddc1的結(jié)構(gòu)變化能夠更好地幫助我們理解9-1-1復(fù)合體如何參與DNA損傷響應(yīng)。Rad24-RFC是一個(gè)異源五聚體,由最大的亞基Rad24和四個(gè)小亞基RFC2-5組成。在DNA損傷修復(fù)過(guò)程中,Rad24-RFC負(fù)責(zé)協(xié)助9-1-1復(fù)合體加載到DNA損傷位點(diǎn),起到穩(wěn)定DNA構(gòu)象和激活DNA損傷檢查點(diǎn)的作用�；�9-1-1復(fù)合體與增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)在結(jié)構(gòu)上的相似性,目前認(rèn)為9-1-1復(fù)合體與Rad24-RFC間相互作用可能與PCNA與RFC間相互作用相似,但是目前并沒(méi)有直接的證據(jù)表明9-1-1復(fù)合體與Rad24-RFC行使相似的機(jī)制。因此,獲得9-1-1復(fù)合體與Rad24-RFC復(fù)合物的完整結(jié)構(gòu)及其動(dòng)態(tài)相互作用的結(jié)構(gòu)信息將會(huì)極大地幫助我們理解clamp加載過(guò)程,但是目前還沒(méi)有二者相互作用的結(jié)構(gòu)信息,甚至連Rad24-RFC的結(jié)構(gòu)信息也很少。本課題我們利用冷凍電鏡技術(shù)解析了釀酒酵母中9-1-1復(fù)合體的完整結(jié)構(gòu),首次解析了Ddc1亞基的全長(zhǎng)結(jié)構(gòu)并發(fā)現(xiàn)Ddc1結(jié)構(gòu)柔性受到精細(xì)調(diào)節(jié)。在正常生理狀態(tài)下,9-1-1復(fù)合體具有多種構(gòu)象,Ddc1 C-tail是高度動(dòng)態(tài)的。我們獲得了三種相對(duì)穩(wěn)定的構(gòu)象,包括Ddc1 C-tail位于環(huán)狀區(qū)域的阻擋DNA結(jié)合的構(gòu)象,Ddc1 C-tail遠(yuǎn)離環(huán)狀區(qū)域的閉合構(gòu)象以及環(huán)打開(kāi)的開(kāi)口構(gòu)象。甲基磺酸甲酯(MMS)是一種DNA損傷誘導(dǎo)劑,能夠造成細(xì)胞基因組發(fā)生斷裂,為了深入研究,我們也獲得了MMS誘導(dǎo)條件下的9-1-1復(fù)合體。在生化上,MMS誘導(dǎo)的9-1-1復(fù)合體的Ddc1亞基在電泳上遷移出多條條帶,質(zhì)譜結(jié)果顯示均為Ddc1,考慮到Ddc1 C-tail包含眾多磷酸化位點(diǎn),這暗示在DNA損傷條件下Ddc1發(fā)生了不同程度的磷酸化。同時(shí)我們也解析了MMS誘導(dǎo)的9-1-1復(fù)合體的完整結(jié)構(gòu),與正常生理狀態(tài)下的9-1-1復(fù)合體結(jié)構(gòu)相比,MMS誘導(dǎo)的9-1-1復(fù)合體構(gòu)象變得均一,Ddc1 C-tail主要位于環(huán)狀區(qū)域外。基于生化和結(jié)構(gòu)分析,Ddc1 C-tail的結(jié)構(gòu)柔性很大可能與DNA損傷響應(yīng)相關(guān)。Rad53作為DNA損傷響應(yīng)的效應(yīng)激酶,是DNA檢查點(diǎn)激活的重要指示劑,我們的磷酸化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),Ddc1 C-tail敲除將會(huì)導(dǎo)致G1/G2期Rad53的磷酸化完全喪失或降低,這一數(shù)據(jù)說(shuō)明Ddcl C-tail在DNA損傷響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。為了解析Rad24-RFC的結(jié)構(gòu),我們嘗試了內(nèi)源性表達(dá)和重組表達(dá)。在內(nèi)源性純化Rad24-RFC時(shí),我們發(fā)現(xiàn)能夠共純化出Mec1/Ddc2(ATR/ATRIP),二維結(jié)構(gòu)分析也發(fā)現(xiàn)存在二者復(fù)合體。在之前的研究中Rad24-RFC一直被認(rèn)為作為clamp loader協(xié)助9-1-1復(fù)合體加載到DNA損傷位點(diǎn),一旦完成,Rad24-RFC將會(huì)從DNA損傷處解離。我們的共純化結(jié)果或許暗示了Rad24-RFC在體內(nèi)能夠與Mec1/Ddc2發(fā)生直接的相互作用。由于內(nèi)源性純化的Rad24-RFC濃度和均一度比較低,因此我們嘗試重組表達(dá)獲得Rad24-RFC樣品。在高鹽、高去垢劑的純化條件下,我們獲得了高濃度和高純度的Rad24-RFC,同時(shí)我們也首次解析了Rad24-RFC的完整結(jié)構(gòu)。在負(fù)染結(jié)構(gòu)中,Rad24-RFC部分構(gòu)象呈現(xiàn)出“U”型結(jié)構(gòu),中間含有一條深溝;部分構(gòu)象呈現(xiàn)出“爪”型。參與DNA復(fù)制的clamp loader RFC復(fù)合體(RFC1-5)與Rad24-RFC共享了四個(gè)相同的小亞基RFC2-5,基于RFC復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu),我們確定了Rad24模塊結(jié)構(gòu)。同時(shí)我們將RFC1與Rad24的density進(jìn)行單獨(dú)比較,二者結(jié)構(gòu)十分相似。結(jié)合PCNA與9-1-1復(fù)合體的結(jié)構(gòu)相似性,Rad24-RFC與RFC復(fù)合體的結(jié)構(gòu)相似或許暗示著這兩對(duì)clamp-clamp loader的相互作用機(jī)制存在一定的相似�；谝陨辖Y(jié)構(gòu)信息,我們也對(duì)9-1-1復(fù)合體與Rad24-RFC間相互作用進(jìn)行了研究,我們發(fā)現(xiàn),二者相互作用在體內(nèi)受到DNA損傷應(yīng)激調(diào)控。在體外我們也成功組裝了Rad24-RFC/9-1-1超級(jí)復(fù)合物,這也為我們后續(xù)解析三維結(jié)構(gòu)奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：Q75
【部分圖文】：

其中ＡＴＲ負(fù)責(zé)啟動(dòng)ＤＮＡ單鏈損傷修復(fù)，ＡＴＭ負(fù)責(zé)啟動(dòng)ＤＮＡ雙鏈損傷修復(fù)，逡逑二者在細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡、ＤＮＡ損傷修復(fù)和染色質(zhì)重塑等方面發(fā)揮重要逡逑作用［５］（圖１．１）。逡逑１逡逑

９－１－１復(fù)合體作為ｃｌａｍｐ在ｃｌａｍｐ邋ｌｏａｄｅｒ邋Ｒａｄ２４－ＲＦＣ的協(xié)助下結(jié)合到ＤＮＡ逡逑單雙鏈損傷處，同時(shí)招募和激活Ｍｅｃｌ／Ｄｄｃ２，激活的Ｍｅｃｌ／Ｄｄｃ２磷酸化下游效逡逑應(yīng)激酶Ｒａｄ５３將損傷信號(hào)傳遞下去從而完成ＤＮＡ損傷修復(fù)過(guò)程［１０］（圖１．２）。逡逑ＤＮＡ損傷檢查點(diǎn)激活是一個(gè)由多個(gè)蛋白參與的多步反應(yīng)過(guò)程，但是目前對(duì)于該逡逑過(guò)程激活機(jī)制還不是很清楚。逡逑本文我們主要以ｃｌａｍｐ邋９－１－１復(fù)合體和ｃｌａｍｐ邋ｌｏａｄｅｒ邋Ｒａｄ２４－ＲＦＣ為研宄對(duì)象逡逑解析二者結(jié)構(gòu)，同時(shí)對(duì)９－１－１復(fù)合體與Ｒａｄ２４－ＲＦＣ間相互作用進(jìn)行研宄。希望對(duì)逡逑于９－１－１復(fù)合體如何在Ｒａｄ２４－ＲＦＣ協(xié)助下加載到ＤＮＡ損傷處這一生物學(xué)過(guò)程有逡逑更深入的理解。逡逑／ｋ逡逑．一邐逡逑ｎｅｒ邐一一’邐逡逑令邐Ｃ＾ｄｃ２邐（Ｒｇ９）逡逑—＞？邋ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ邋ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ邋ｂｙ邋Ｍｅｃｌ邐ｃｅｉｌ邋ｃｙｃｌｅ逡逑—？邋Ｄｄｃ１－ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ邋ｂｙ邋Ｍｅｃｌ邐ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ逡逑—？邋Ｒａｄ５３邋ｔｒａｎｓｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ邐ｒｅｐａｉｒ逡逑圖１．２釀酒酵母中ＤＮＡ損傷檢g慵せ钅Ｐ停郟

本文編號(hào)：2816296