目的:應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù),篩選出調(diào)控鹿茸的快速生長和骨化的差異表達(dá)基因,為鹿茸快速生長及骨化機(jī)制研究提供理論依據(jù)。方法:采用Trizol法提取鹿茸生長中心軟骨組織中總RNA,通過BioSpec-nano微量紫外可見分光光度計(jì)和非變性瓊脂糖電泳對(duì)RNA樣品質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)。采用TruSeq Stranded mRNA試劑盒進(jìn)行測(cè)序文庫構(gòu)建。在Illumina Hiseq 2000平臺(tái)上進(jìn)行文庫測(cè)序。采用Illumina HCS 1.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換,去除低質(zhì)量序列和載體序列。采用Trinity軟件進(jìn)行從頭組裝。通過BLASTX比對(duì)程序,將測(cè)序組裝數(shù)據(jù)與nr、Swiss-Prot蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)。采用RPKM法進(jìn)行基因表達(dá)量分析,采用DEGseq軟件包對(duì)快速生長期和骨化期軟骨組織進(jìn)行差異基因表達(dá)分析,并找出與軟骨生長和骨化相關(guān)的差異表達(dá)基因。通過對(duì)隨機(jī)選取的一些和骨生長發(fā)育相關(guān)的因子進(jìn)行qPCR驗(yàn)證。結(jié)果:1通過對(duì)快速生長期和骨化期梅花鹿茸生長中心軟骨組織轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,分別獲得測(cè)序數(shù)據(jù)4.47和4.45 Gb。經(jīng)過Trinity軟件進(jìn)行組裝后,前者得到48883個(gè)contigs,經(jīng)過拼接,得到39377個(gè)unigenes,平均長度為1138 nt。后者得到45668個(gè)contigs,經(jīng)過拼接,得到37331個(gè)unigenes,平均長度為1143 nt。2將Unigenes與nr、Swiss-Prot蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì),共有20551條Unigenes可以同時(shí)與兩個(gè)數(shù)據(jù)庫比對(duì)上。將與GO數(shù)據(jù)庫比對(duì)上的Unigenes進(jìn)行GO功能分類,其被歸類到61個(gè)功能類別中,歸類至細(xì)胞和細(xì)胞組分中的基因數(shù)目最多。通過KEGG代謝通路分析,共有26543條基因注釋到252個(gè)信號(hào)通路中,注釋到代謝通路(Metabolic pathways)和粘著斑通路(Focal adhesion)中的基因數(shù)目最多。3總共篩選出差異表達(dá)基因4422條,將骨化期與快速生長期比較,有2493條差異表達(dá)基因顯著上調(diào),有1929條差異表達(dá)基因顯著下調(diào)。4通過進(jìn)一步篩選與軟骨生長和骨化密切相關(guān)的差異表達(dá)基因,快速生長期顯著上調(diào)的基因包括6種生長因子,Fgf7、Fgf11、Hgf、Igf1、Egfl6和Vegfd;7種轉(zhuǎn)錄因子,Atf6β、Sox12、Elf4、Elf2、Runx1、Mafk和Tcf4;3種膠原類成分,Col8a1、Col14a1和Col16a1。骨化期顯著上調(diào)的基因包括1種生長因子,Vegfc;5種轉(zhuǎn)錄因子,Sox8、Sox9、Gtf3a、Atf3和Maff;5種膠原類成分,Col9a、Col10a、Col2a1、Col25a1和Col27a1。5對(duì)隨機(jī)選取的一些和骨生長發(fā)育相關(guān)的因子進(jìn)行qPCR驗(yàn)證,我們發(fā)現(xiàn),其結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組分析的結(jié)果基本一致。結(jié)論:鹿茸生長中心軟骨組織在快速生長期和骨化期生長因子、轉(zhuǎn)錄因子以及膠原類等基因發(fā)生了顯著差異。
【學(xué)位單位】：長春中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S865.4;Q811.4
【部分圖文】：

圖 1 總 RNA 瓊脂糖電泳檢測(cè)結(jié)果 RNA 2：LEC 總 RNA M：DL10,000TM量評(píng)價(jià)組數(shù)據(jù)經(jīng)過凈化后得到 clean reads，見表

堿基含量分布圖

碩士學(xué)位論文14圖 2 堿基含量分布圖圖 3 堿基質(zhì)量分布圖3.3 Illumina/Solexa 序列組裝結(jié)果首先是 LCC 樣品，經(jīng)過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得 44715694 reads ，組裝后得到 48883 個(gè)contigs，其平均長度是 1006 nt，N50 值為 2091 nt，N70 值為 1159 nt，N90 值為 355nt，GC 值（GC：堿基 G 和 C 的比例）為 50.22%；然后是 LEC 樣品

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2 陳U

本文編號(hào)：2816376