架雜交構(gòu)樹(Broussonetiakazinoki ×Broussonetiapapyifera)被廣泛應(yīng)用于造紙、飼料、醫(yī)藥等行業(yè),并在扶貧產(chǎn)業(yè)、環(huán)境保護(hù),生態(tài)修復(fù)上發(fā)揮重要作用。在高等植物中,多糖代謝在調(diào)控纖維素、半纖維素、果膠和胼胝質(zhì)等細(xì)胞壁物質(zhì)的形成、營養(yǎng)器官的生長及生殖器官的發(fā)育過程發(fā)揮重要作用。尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶(UGDH)是半纖維素和果膠生物合成途徑中的關(guān)鍵酶,其以NAD+為輔酶催化UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)化為UDP-葡萄糖醛酸酯(UDP-GlcA),進(jìn)而參與植物生長發(fā)育的調(diào)控。因此,研究雜交構(gòu)樹UGDH基因的功能和表達(dá)特性對于該多功能綜合性樹種的開發(fā)利用具有重要意義。本研究從雜交構(gòu)樹中分離UGDH基因及其啟動子,并分析BpUGDH的表達(dá)模式及功能,同時對低溫脅迫和正常生長的雜交構(gòu)樹組織培養(yǎng)苗,進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析,對獲得的差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋與歸類,構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)。旨在提高雜交構(gòu)樹的生長發(fā)育和適應(yīng)性,拓展其栽培區(qū)域,并為雜交構(gòu)樹的分子育種提供耐寒性的候選基因。主要結(jié)果如下:(1)利用兼并-PCR及RACE技術(shù)克隆分離了雜交構(gòu)樹UGDH基因,命名為BpUGDH。BpUGDH基因cDNA包含1443bp的開放閱讀框,編碼480個氨基酸,其蛋白分子量為53.04kDa,理論等電點為5.98;BpUGDH與苧麻的UGDH親緣關(guān)系較近,定位于葉綠體中。(2)利用Real time Q-PCR技術(shù)對BpUGDH基因的表達(dá)模式進(jìn)行調(diào)查結(jié)果顯示,BpUGDH基因在雜交構(gòu)樹的根、莖和葉中均能穩(wěn)定的表達(dá),且莖中的表達(dá)量最高。(3)利用Genome Walking技術(shù)從雜交構(gòu)樹基因組中分離了1324bp的BpUGDH基因啟動子,利用GUS報告基因深入分析了BpUGDH的表達(dá)模式發(fā)現(xiàn),Pro.BpUGDH::GUS在轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗及生長旺盛組織中高效表達(dá),在成熟組織中表達(dá)量明顯下降,種子中沒有檢測到該基因的表達(dá)。激素誘導(dǎo)和低溫脅迫實驗證實,Pro.BpUGDH::GUS的表達(dá)受乙烯、赤霉素、生長素、茉莉酸甲酯和低溫的誘導(dǎo)。(4)利用同源重組方法構(gòu)建pBI101-BpUGDH雙元表達(dá)載體,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花絮浸染法遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥,分析BpUGDH基因的功能。結(jié)果顯示:BpUGDH基因在擬南芥中的過量表達(dá)增加了轉(zhuǎn)基因株系體內(nèi)可溶性糖的含量,促進(jìn)了半纖維素和果膠的積累,提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥的營養(yǎng)生長,并且四個轉(zhuǎn)基因株系均表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐寒能力。(5)雜交構(gòu)樹組培苗進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序共獲得59056條unigenes。通過BLAST軟件與常用的6大數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析,結(jié)果在NR數(shù)據(jù)庫31358個unigenes有比對結(jié)果且與川桑(Morus notabilis)的相似數(shù)為最多,達(dá)到了60.40%;在Swiss-Prot、Pfam、COG、GO、KEGG 數(shù)據(jù)庫中分別 27426、23431、7957、18183、15574 個 unigenes有比對結(jié)果。(6)低溫脅迫下雜交構(gòu)樹中篩選出7320個差異unigenes,其中上調(diào)表達(dá)基因3219個,下調(diào)表達(dá)基因4101個。差異表達(dá)基因的GO功能注釋結(jié)果顯示,催化活性、代謝進(jìn)程、膜活性、結(jié)合活性、細(xì)胞進(jìn)程、單生物進(jìn)程和覆膜部分中涉及的unigenes較多;1552個基因被注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫,涉及的通路有124個,富集通路主要集中在新陳代謝部分。(7)利用String 11.0數(shù)據(jù)庫的擬南芥蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)為參考,進(jìn)行差異表達(dá)基因的蛋白PPIs預(yù)測,篩選出PCNA2、THY-1、DUT1和CDC2等四個互作度較高的蛋白;采用同樣的方法從BpUGDH基因功能富集獲得的3個基因集中,共篩選出47個基因并進(jìn)行蛋白互作預(yù)測獲得了與其具有緊密、相互作用的9個蛋白,并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果初步探討了BpUGDH基因提高植物耐寒性機(jī)制。
【學(xué)位單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S792.99;Q943.2
【部分圖文】：

圖３邋５ＷＡＣＥ反應(yīng)的原理圖逡逑Ｆｒｉｇ．邋３邋Ｄｅｔａｉｌｅｄ邋ｍｅｃｈａｎｉｓｍ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋５＇－ＲＡＣＥ邋ｒｅａｃｔｉｏｎｓ逡逑ａ．邋ＢｐＵＧＤＨ邋５＇－ＲＡＣＥ邋ＰＣＲ邋ＧｆｌｊＣ邋ＰＣＲ）逡逑１邋ｓｔ邋ＰＣＲ擴(kuò)增反應(yīng)：按及８所示休積配制ＰＣＲ邋Ｍａｓｔｅｒ邋Ｍｉｘ。額外多加？個反量，以保證有足夠的休積。逡逑表８邋Ｍａｓｔｅｒ邋Ｍｉｘ反應(yīng)體系逡逑Ｔａｂｌｅ．Ｘ邋Ｔｈｅ邋ｓｙｓｔｅｍ邋ｆｏｒ邋Ｍａｓｔｅｒ邋Ｍｉｘ逡逑ｏｍｐｏｎｅｎｔ邐Ｖｏｌｕｍｅ邋（ｕＬ）ＣＲ－Ｇｒａｄｅ邋Ｈ：０邐１５．５逡逑ｘＳｅｑＡｍｐ邋Ｂｕｆｆｅｒ邐２５．０逡逑ｅｑＡｍｐ邋ＤＮＡ邋Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ邐１．０逡逑ｏｔａｌ邐４Ｌ５按Ｋｌｆｌ丨順抒把各組分加入到０．５邋ｍｌ邋ＰＣＲ邋ｔｕｂｅｓ中，輕柔混６ｊ，邋ｌｉｌ制ＰＣＲ反丨、Ｖ：液°°°°

圖４邋３ＶＡＣＥ反應(yīng)的原理圖逡逑Ｆｉｇ．４邋Ｄｅｔａｉｌｅｄ邋ｍｅｃｈａｎｉｓｍ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋３＇－ＲＡＣＥ邋ｒｅａｃｔｉｏｎｓ逡逑ＰＣＲ擴(kuò)增反應(yīng)：配制ＰＣＲ邋Ｍａｓｔｅｒ邋Ｍｉｘ同５＇－ＲＡＣＥ邋ＰＣＲ反應(yīng)。反應(yīng)體ＰＣＲ邋反應(yīng)條件為：９４°Ｃ邋３ｍｉｎ；邋９４°Ｃ邋３０ｓ，６８°Ｃ邋３０ｓ，邋７２°Ｃ邋ｌｍｉｎ，２５邋ｉｎ作為eA終延伸。逡逑表１１邋ｙ－ＲＡＣＥ邋１ｓｔ邋ＰＣＲ擴(kuò)增反應(yīng)體系逡逑Ｔａｂｌｅ．邋１１邋Ｔｈｅ邋ｆｉｒｓｔ－ＰＣＲ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ邋ｓｙｓｔｅｍ邋ｆｏｒ邋３＇－ＲＡＣＥ逡逑ｎｔ邐Ｖｏｌｕｍｅ邋（ｕＬ）－Ｒｅａｄｙ邋ｃＤＮＡ邐１．５逡逑５．０逡逑１邋（１０｜ｉＭ）邐２．０逡逑ｉｘ邋（Ｓｔｅｐ邋１）邐４１．５逡逑５００邋ＰＣＲ擴(kuò)增反應(yīng)：將１ｓｔ邋ＰＣＲ產(chǎn)物稀釋５０倍，代替２ｎｄ邋ＰＣＲ擴(kuò)枘反

以雜交構(gòu)樹葉片總ＲＮＡ反轉(zhuǎn)錄ｃＤＮＡ為模板，利用克隆興安落葉松Ｌｇｔ／ＧＤ／／／逡逑基因的兼并引物進(jìn)行巢式ＰＣＲ反應(yīng)。經(jīng)兩次兼并ＰＣＲ擴(kuò)增獲得的產(chǎn)物經(jīng)１．０％瓊脂逡逑糖凝膠電泳分離，結(jié)果見圖６。由此可見，第二輪兼并ＰＣＲ擴(kuò)增出一條明亮的７５０ｂｐ逡逑左右的特異條帶；將該擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收、與ＰＭＤ１９－Ｔ載體連接及轉(zhuǎn)化大腸桿菌；逡逑對鑒定為陽性的菌落進(jìn)行擴(kuò)培、測序，獲得了邋７５２ｂｐ的序列。通過ＮＣＢ丨的Ｂｌａｓｔ邋Ｘ逡逑在線軟件進(jìn)行分析的結(jié)果顯示與其他植物的同源性在８５％以上推測其為基逡逑因ｃＤＮＡ片段。逡逑ｉｏｏ0ｂｐ邋ＭｓＢ逡逑■逡逑圖６兼并ＰＣＲ反應(yīng)產(chǎn)物電泳圖逡逑Ｆｉｇ．６邋Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ邋ＰＣＲ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ逡逑注：Ｍ為２００ｂｐ邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ，邋１為第二次ＰＣＲ產(chǎn)物，２為第一次ＰＣＲ產(chǎn)物，逡逑２．３．１．２克隆基因末端序列逡逑通過５Ｖ３’邋ＲＡＣＥ－ＰＣＲ擴(kuò)增獲得卸ｔ／ＧＤ／／基因的末端序列，分別為：７８９ｂｐ的逡逑３’末端序列（圖７）和６７２ｂｐ的５＇末端序列（圖８）。利用ＮＣＢＩ的Ｂｌａｓｔ邋Ｘ在線軟件逡逑對測序獲得的序列進(jìn)行比對分析發(fā)現(xiàn)，與番木瓜、接子（Ｃ／７ｍｖ逡逑ｉ’／／乻訪）、核桃、葡萄（ｒ／ｔｏｖ／ｗ／ｙ＾ｒａ）等其他物種的ｔ７ＧＺ）／／基因逡逑

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本文編號：2814201