小麥雄性不育突變體HTS-1中TaEPFL1基因的克

發(fā)布時(shí)間：2020-09-08 12:12

　　雄蕊是植物花器官的重要組成結(jié)構(gòu)之一,它的生長(zhǎng)發(fā)育情況會(huì)對(duì)植物的繁育和農(nóng)作物的產(chǎn)量產(chǎn)生直接影響。雄性不育是雄蕊發(fā)育異常不能產(chǎn)生可育后代的一種自然現(xiàn)象,在雜交育種的過程中,雄性不育系植株在提高作物的產(chǎn)量、品質(zhì)以及增強(qiáng)植物抗性和適應(yīng)性等方面具有重要的作用。小麥(Triticum aestivum L.)是非常重要的糧食作物,在雜交制種中,小麥的雄性不育系可作為母本產(chǎn)生品質(zhì)和產(chǎn)量?jī)?yōu)于親本的雜交子代;該方法簡(jiǎn)便,可以消除人工授粉的困難還可提高后代種子純度。因此,研究小麥雄蕊發(fā)育的過程對(duì)于利用分子育種技術(shù)改良小麥性狀和提高小麥的產(chǎn)量具有重要的意義。小麥雄蕊同源轉(zhuǎn)化型不育突變體HTS-1是彭正松教授首次在以三雌蕊突變體(Three pistils mutation,TP)為供體親本和中國(guó)春(Chinese spring,CS)為受體親本所構(gòu)建的近等基因系(CSTP)群體中意外發(fā)現(xiàn)的一類新穎的小麥花器官突變體,屬于CSTP的變異植株。在HTS-1的小花中雄蕊全部或部分的同源轉(zhuǎn)化為雌蕊,故雄蕊數(shù)目少于3個(gè),其雌蕊數(shù)目多于3個(gè),雄蕊形態(tài)異常,無法產(chǎn)生正常可育花粉,故雄蕊全部或部分不育。而且,HTS-1與早期發(fā)現(xiàn)的核質(zhì)互作的雄性不育小麥完全不同,該突變體無外源細(xì)胞質(zhì),該雌蕊化性狀是由兩個(gè)隱性核基因hts-1和hts-2共同調(diào)控,這一特性對(duì)于單獨(dú)研究核基因控制的雄蕊同源轉(zhuǎn)化為雌蕊的現(xiàn)象有很大的幫助。因此,HTS-1突變體是研究小麥花器官發(fā)育的優(yōu)質(zhì)材料。前期為了進(jìn)一步研究雌蕊化性狀產(chǎn)生的分子機(jī)制,楊在君等人對(duì)HTS-1的雌蕊化雄蕊(PS)和雌蕊(P)以及CSTP的雄蕊(S)進(jìn)行RNA-seq分析,從中篩選得到一段表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)序列(comp109492_c0),該序列所對(duì)應(yīng)的基因在HTS-1和CSTP中出現(xiàn)差異性表達(dá)。在本研究中,我們將進(jìn)一步研究該基因的結(jié)構(gòu)與功能,探究其在小麥花發(fā)育過程中是否能夠調(diào)控花器官的發(fā)育。通過基因克隆技術(shù)分別克隆出了目的基因的cDNA和基因組DNA序列,并對(duì)所得序列進(jìn)行了氨基酸序列比對(duì)、染色體定位、創(chuàng)建系統(tǒng)發(fā)育樹等生物信息學(xué)方面的分析,同時(shí)運(yùn)用qRT-PCR分析了目的基因在花器官中的表達(dá)模式,隨后通過擬南芥轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)一步分析了該基因的功能,主要結(jié)果如下:1.克隆測(cè)序后經(jīng)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),該基因具有3個(gè)同源基因,而且三個(gè)同源基因的相似性高達(dá)98.18%,其氨基酸序列與節(jié)節(jié)麥(Aegilops tauschii)AeEPFL1分別具有100%,95.83%,95.83%的相似性,故將其命名為TaEPFL1.1,TaEPFL1.2,TaEPFL1.3(Gene Bank登錄號(hào)分別為:MH638998.1,MH638999.1,MH639000.1)。3個(gè)同源基因的開放閱讀框(ORF)長(zhǎng)度為363bp,編碼120個(gè)氨基酸,其中TaEPFL1.2和TaEPFL1.3的ORF完全相同。基因結(jié)構(gòu)分析表明TaEPFL1的三個(gè)同源基因的序列長(zhǎng)度分別為728bp、713bp和753bp,均由2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成,其對(duì)應(yīng)外顯子的長(zhǎng)度無差異。2.通過以小麥雙端體(Dt)和缺體-四體(NT)為材料的染色體定位分析表明TaEPFL1.1,TaEPFL1.2和TaEPFL1.3這3個(gè)同源基因分別位于染色體6D、6B和6A上。3.聚類分析表明TaEPFL1.1和TaEPFL1.2這兩個(gè)同源序列與花藥野生稻Oryza brachyantha ObEPFL1,二穗短柄草Brachypodium distachyon BdEPFL1,節(jié)節(jié)麥Aegilops tauschii AeEPFL1及擬南芥Arabidopsis thaliana AtEPFL1聚為一類,同屬EPFL1蛋白,與節(jié)節(jié)麥(Aegilops tauschii)親緣關(guān)系最近。4.Real-time PCR結(jié)果表明,TaEPFL1.1和TaEPFL1.2在花器官中表現(xiàn)出相似的表達(dá)模式,在雌蕊化雄蕊(PS)中表達(dá)量最高,約為正常雌蕊(P)的20倍,正常雄蕊(S)的15倍。5.通過TaEPFL1基因在擬南芥中過量表達(dá),我們發(fā)現(xiàn),野生型Col-0(Columbia)每朵小花的花絲數(shù)量始終為每朵花6條,而轉(zhuǎn)基因植株每朵花的花絲數(shù)量為2到6條不等;在精確授粉階段,Col-0的6條花絲的長(zhǎng)度與柱頭等長(zhǎng)或更長(zhǎng),而轉(zhuǎn)基因植株的花絲明顯短于柱頭,轉(zhuǎn)基因的花絲與柱頭比值在0.35-0.79之間;在生殖生長(zhǎng)結(jié)束后,轉(zhuǎn)基因植物的大部分角果都是短的、空的,不能產(chǎn)生種子,有些只有殘余的花梗;在轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉片,花絲,角果中TaEPFL1的表達(dá)水平均顯著高于野生型擬南芥;在轉(zhuǎn)基因株系中,通過對(duì)控制乙烯合成通路的三個(gè)限速酶基因AtACS,AtSAM和AtACO2的表達(dá)水平進(jìn)行分析,結(jié)果表明AtACO2表達(dá)量在轉(zhuǎn)基因株系中顯著降低,然而,AtACS和AtSAM的表達(dá)在這些轉(zhuǎn)基因株系中沒有顯示出規(guī)律性的變化。本研究分析和鑒定了TaEPFL1基因的結(jié)構(gòu)和功能。通過對(duì)TaEPFL1基因功能的研究,證實(shí)了TaEPFL1基因能夠調(diào)控小麥雄蕊的發(fā)育,可能抑制乙烯的生物合成,為進(jìn)一步闡明小麥雄蕊同源轉(zhuǎn)化為雌蕊的分子機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù)。
【學(xué)位單位】：西華師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S512.1;Q943.2
【部分圖文】：