Harpin蛋白是由hrp基因編碼的抗病激活蛋白,也是一種耐熱蛋白,通過革蘭氏陰性植物病原細(xì)菌Ⅲ型泌出系統(tǒng)(Type Ⅲ secretion system,T3SS)分泌,既能誘導(dǎo)非寄主植物產(chǎn)生過敏性壞死反應(yīng)(Hypersensitive response,HR),同時其本身又是病原菌的一種致病因子。目前國內(nèi)外對Harpin蛋白的作用機(jī)制已有深入研究,但對于它的耐熱機(jī)制尚未見專門的研究報(bào)道。為了研究HarpinX的耐熱機(jī)制,本研究以來自黃單胞菌的HpaXm、Hpa1Xoo、HpaXam和HpaXcm為材料,利用生物信息學(xué)技術(shù)深入分析了蛋白結(jié)構(gòu)特征;通過煙草葉片表型試驗(yàn)和實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù),從表觀和微觀兩方面探索了高溫對蛋白功能的影響;通過檢測蛋白吸光度和圓二色(Circular dichroism,CD)光譜,探究了高溫對蛋白結(jié)構(gòu)的影響:利用定點(diǎn)突變技術(shù)對蛋白coiled-coil(CC)結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造,驗(yàn)證了 CC結(jié)構(gòu)與蛋白熱穩(wěn)定性的關(guān)系。主要研究結(jié)果如下:1.通過煙草葉片HR表型試驗(yàn)分析比較4種HarpinX蛋白的熱穩(wěn)定性,發(fā)現(xiàn)高溫對Hpa1Xoo和HpaXcm的HR活性影響不明顯,說明熱穩(wěn)定性較好;高溫使得HpaXm和HpaXam的HR活性明顯下降,說明熱穩(wěn)定性較差。2.通過檢測蛋白吸光度,發(fā)現(xiàn)HarpinX吸光度隨處理溫度的增加而上升,推測高溫使包埋在結(jié)構(gòu)內(nèi)部的苯丙氨酸逐漸暴露,蛋白結(jié)構(gòu)逐漸展開。通過CD光譜檢測二級結(jié)構(gòu)含量,發(fā)現(xiàn)高溫處理后HarpinX的α-螺旋含量增加至接近100%。進(jìn)一步證實(shí)高溫使HarpinX的蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,促進(jìn)其他二級結(jié)構(gòu)向α-螺旋轉(zhuǎn)化。3.通過表型試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),HarpinX的HR活性隨高溫變化不明顯。利用qRT-PCR對NtEXP6、Hin1、HSR203J、NPR1、PR-1a表達(dá)情況進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)高溫使各基因表達(dá)量發(fā)生了不同程度的變化。推測HarpinX的耐熱性與蛋白空間結(jié)構(gòu)關(guān)系微弱,但蛋白誘導(dǎo)基因表達(dá)的能力與蛋白空間結(jié)構(gòu)關(guān)系密切。4.利用生物信息學(xué)對蛋白進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)在HarpinX蛋白N末端的α-螺旋區(qū)域都能夠形成CC結(jié)構(gòu),但形成的可能性各有不同。利用定點(diǎn)突變技術(shù)改造CC結(jié)構(gòu),成功獲得突變體 HpaXmAL39A、HpaXmAD40A、Hpa1XooAL40A、Hpa1Xoo△D41A、HpaXam△L44A、HpaXamAM54L、HpaXcmAL40A 和 HpaXcmAD41A。通過 Western blot發(fā)現(xiàn),HpaXam的Leu44對蛋白可溶性表達(dá)至關(guān)重要。結(jié)合CC結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn),若破壞CC的形成,相應(yīng)突變體的熱穩(wěn)定性隨之變?nèi)?反之,若加強(qiáng)CC的形成,相應(yīng)突變體的熱穩(wěn)定性隨之增強(qiáng)。5.綜合以上結(jié)果推測,高溫使HarpinX的空間結(jié)構(gòu)逐漸展開,但蛋白的HR活性具有耐熱性,可能是由于高溫?zé)o法破壞蛋白的氨基酸序列,所以序列中heptad的關(guān)鍵氨基酸仍能夠通過疏水作用力形成CC結(jié)構(gòu),因此高溫處理后的HarpinX蛋白仍然能與煙草葉片中的互作蛋白進(jìn)行互作,從而產(chǎn)生HR壞死斑。對HarpinX蛋白的耐熱機(jī)制進(jìn)行初探,不僅為深入研究Harpin蛋白的作用機(jī)理奠定基礎(chǔ),也為改造工業(yè)上非耐熱蛋白提供理論依據(jù)。
【學(xué)位單位】：海南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S432.1
【部分圖文】：

旋相互作用模型示意圖（石劉飛，２０ｍａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ａ－ｈｅｌｉｃｅｓ邋ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ體；Ｂ：三聚體；Ｃ：四聚體；Ｄ：ｅｒ；邋Ｂ：邋Ｔｒｉｍｅｒ；邋Ｃ：邋Ｔｅｔｒａｍｅｒ；邋Ｄ：邋Ｈｅｘａ一個單體，ａｂｃｄｒｆｇ為ｈｅｐｔａｄ邋ｒｅｐｅａｔｒｅｓｅｎｔｓ邋ａ邋ｓｉｎｇｌｅ，邋ａｍｉｎｏ邋ａｃｉｄ邋ｎｕｍｂｅｒｓ邋ｗ構(gòu)特征，隨著研究的不斷深入，面。利用ＣＣ結(jié)構(gòu)結(jié)合親和層析用Ｅ３／Ｋ３的ＣＣ結(jié)構(gòu)來共純２０１２）。目前，根據(jù)此原理己經(jīng)方面，利用ＣＣ結(jié)構(gòu)進(jìn)行藥物的實(shí)現(xiàn)藥物緩釋效果，避免藥物對上識別到活性蛋白和受體（Ｌｅｅｔａｌ．加以運(yùn)用，Ｃｈａｏ等人設(shè)計(jì)合成的

圖７邋ＨａｒｐｉｎＸ蛋白ｃｏＨｅｄ－ｃｏｉｌ結(jié)構(gòu)的預(yù)測逡逑Ｆｉｇ．７邋Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ＨａｒｐｉｎＸ逡逑．１．５邋ＨａｒｐｉｎＸ蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測逡逑三維結(jié)構(gòu)模型表明，ＨａｒｐｉｎＸ的結(jié)構(gòu)中均有兩個主要的ａ－螺旋（圖８）ｅｕ４２、Ｌｅｕ４６邋和邋Ａｌａ４９邋是形成邋ＨｐａＸｍ邋中邋ＣＣ邋結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵氨基酸，Ｌｅｕ４０、ＬｅＡｌａ５０是形成ＨｐａｌＸｏｏ中ＣＣ結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵氨基酸，Ｌｅｕ４４、Ｌｅｕ４７、Ｌｅｕ５１形成ＨｐａＸａｍ中ＣＣ結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵氨基酸，Ｌｅｕ４０、Ｌｅｕ４３、Ｌｅｕ４７和ＡｌａｐａＸｃｍ中ＣＣ結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵氨基酸（圖８），而這些氨基酸都位于心螺旋的）0逡逑

６０邋—逡逑４0邋ｖ邋ＳＳ邋ｍｍ邐ＭＷｒ邐—邋ＧＳＴ－Ｈａ＿逡逑３０邋ｍ邋Ｓ８邐．逡逑：■ＩＰ＇邋１ＨＩ邋灥＿Ｖ邐＊＂￣邋ＧＳＴ逡逑２０邋？■？邋＞：逡逑圖１１邋ＧＳＴ－ＨａｒｐｉｎＸ融合蛋白的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析逡逑Ｆｉｇ．ｉｌ邋ＳＤＳ－ＰＡＧＥ邋ｏｆ邋ｆｕｓｉｏｎ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ＧＳＴ－ＨａｒｐｉｎＸ逡逑Ｍ：蛋白邋ｍａｒｋｅｒ；邐ｐＧＥＸ邋空載不誘導(dǎo)：２：邋ｐＧＥＸ－ＨｐａＸｍ邋不誘導(dǎo)：３：邋ｐＧＥＸ－Ｈｐａ丨Ｘｏｏ邋不誘逡逑導(dǎo)；４：邋ｐＧＥＸ－ＨｐａＸａｍ邋不誘導(dǎo)；５：邋ｐＧＥＸ－ＨｐａＸｃｍ邋不誘導(dǎo)：６：邋ｐＧＥＸ邋空載誘導(dǎo)；７：邋ｐＧＥＸ－ＨｐａＸｍ逡逑誘導(dǎo)：８：邋ｐＧＥＸ－ＨｐａｌＸｏｏ邋誘導(dǎo)；９：邋ｐＧＥＸ－ＨｐａＸａｍ邋誘導(dǎo)；１０：邋ｐＧＥＸ－ＨｐａＸｍ邋誘導(dǎo)；下同逡逑Ｍ：邋Ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｍａｒｋｅｒ；邋１：邋ｐＧＥＸ邋ｗｉｔｈｏｕｔ邋ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ；邋２：邋ｐＧＥＸ－ＨｐａＸｍ邋ｗｉｔｈｏｕｔ邋ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ；邋３：逡逑ｐＧＥＸ－ＨｐａｌＸｏｏ邋ｗｉｔｈｏｕｔ邋ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ；邋４：邋ｐＧＥＸ－ＨｐａＸａｍ邋ｗｉｔｈｏｕｔ邋ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ；邋５：邋ｐＧＥＸ－ＨｐａＸｃｍ逡逑ｗｉｔｈｏｕｔ邋ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ；邋６：邋ｐＧＥＸ邋ｗｉｔｈ邋ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ；邋７：邋ｐＧＥＸ－ＨｐａＸｍ邋ｗｉｔｈ邋ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ；邋８：邋ｐＧＥＸ－ＨｐａｌＸｏｏ逡逑ｗｉｔｈ邋ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ；邋９：邋ｐＧＥＸ－ＨｐａＸａｍ邋ｗｉｔｈ邋ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ；邋１０：邋ｐＧＥＸ－ＨｐａＸｍ邋ｗｉｔｈ邋ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ；邋ｔｈｅ邋ｓａｍｅ逡逑ｂｅｌｏｗ逡逑ｋＤａ邋Ｍ邋１邐２邐３邐４邐５邐６邐７邐８

【參考文獻(xiàn)】

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4 石宣明,劉淑珍,黃玉碧;嗜熱酶耐熱機(jī)制的研究進(jìn)展[J];科學(xué)技術(shù)與工程;2004年09期

5 沈星燦,梁宏,何錫文,王新省;圓二色光譜分析蛋白質(zhì)構(gòu)象的方法及研究進(jìn)展[J];分析化學(xué);2004年03期

6 張偉玉,楊靜慧,劉玉冬,柳樹梧,羅云波,劉艷軍;水楊酸對NR基因的表達(dá)和乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響[J];西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2003年03期

7 聞偉剛,王金生;水稻白葉枯病菌harpin基因的克隆與表達(dá)[J];植物病理學(xué)報(bào);2001年04期

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本文編號：2814136