筆筒樹(Sphaeropteris lepifera(Hook.)R.M.Tryon)屬于侏羅紀(jì)孑遺的唯一樹狀蕨(Tree ferns)桫欏科(Cytheaceae)植物,其在植物系統(tǒng)演化中扮演著獨(dú)特的角色。而近年來(lái),筆筒樹野生種群生長(zhǎng)環(huán)境受到破壞,幼苗又出現(xiàn)數(shù)量減少、成活率低等問(wèn)題,因此研究筆筒樹生殖機(jī)制對(duì)解決其生殖障礙具有重要的意義。DNA甲基化作為表觀遺傳學(xué)的重要組成部分,其在植物整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程中都發(fā)揮著關(guān)鍵作用。目前,對(duì)于DNA甲基化模式是否能夠穩(wěn)定遺傳,是否在性別分化中作為誘導(dǎo)因子作用,尚沒(méi)有統(tǒng)一觀點(diǎn)。但是植物在生殖過(guò)程中,許多基因的表達(dá)都是通過(guò)去甲基化完成的,可見(jiàn)DNA甲基化對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要。S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作為DNA甲基化的甲基供體,對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和抵抗逆境脅迫有重要作用。5-氮雜胞嘧啶核苷(5-azaC)能夠通過(guò)嵌入DNA與甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)合,從而抑制甲基化狀態(tài)的維持。因此,我們采用這兩種化學(xué)物質(zhì)來(lái)處理筆筒樹的配子體,以期探究DNA甲基化與筆筒樹性別分化的關(guān)系。結(jié)果如下:(1)使用5-azaC和SAM處理了筆筒樹配子體,通過(guò)統(tǒng)計(jì)其成苗率、雌雄配子體比率和配子體精子器頸卵器的數(shù)目發(fā)現(xiàn):5-azaC對(duì)筆筒樹成苗率的影響不大,SAM處理筆筒樹的成苗率升高;5-azaC促進(jìn)雄配子體的分化,在濃度100μM時(shí)表現(xiàn)得尤為明顯;SAM能夠促進(jìn)雌雄配子體的分化,而且降低了無(wú)性配子體(未分化)的比率,在一定程度上可以說(shuō)明SAM能夠促進(jìn)筆筒樹配子體的提前發(fā)育。5-azaC能大幅度促進(jìn)雄配子體的發(fā)育,包括精子器數(shù)目增多、精子器分布區(qū)域擴(kuò)大等。(2)使用LC-MS/MS方法測(cè)定了5-azaC和SAM處理筆筒樹配子體的總胞嘧啶甲基化率。結(jié)果表明,5-azaC能夠提高筆筒樹配子體的甲基化率,在3h、24h、48h、96h分別達(dá)到了約18.80%、18.04%、23.10%、29.45%。SAM處理筆筒樹配子體,其甲基化率呈先升高后降低的趨勢(shì),在3h、24h、48h、96h分別達(dá)到了約11.80%、5.06%、4.82%、4.92%。(3)使用MSAP方法分析了5-azaC和SAM處理的筆筒樹配子體DNA CCGG甲基化的變化。結(jié)果表明:64對(duì)引物組合共擴(kuò)增出多態(tài)性條帶2411條,其中總甲基化條帶數(shù)在940~1166之間,對(duì)照組筆筒樹DNA CCGG點(diǎn)位的總甲基化率為38.99%,全甲基化率為16.76%,半甲基化率為22.23%,單鏈DNA外部甲基化、DNA雙鏈內(nèi)部甲基化和雙鏈DNA外部甲基化分別占18.08%、24.89%和57%;5-azaC處理能夠提高筆筒樹DNA CCGG點(diǎn)位的總甲基化率(42.51%),降低全甲基化率(16.26%),提高半甲基化率(26.26%),甲基化多態(tài)性比率是84.25%,去甲基化所占比重大(52.91%),超甲基化所占比重小(31.34%);SAM處理能夠提高筆筒樹DNA CCGG點(diǎn)位的總甲基化率(48.36%),提高全甲基化率(31.36%),降低半甲基化率(19.33%),甲基化多態(tài)性比率為73.53%,去甲基化所占比重小(33.21%),超甲基化所占比重大(40.32%)。
【學(xué)位單位】：哈爾濱師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q943
【部分圖文】：

圖 2-1 不同處理下筆筒樹的成苗率注：不同字母代表其在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異（p<0.05）Fig.2-1The seeding rate of Sphaeropteris lepifera under different treamentsNote: different letters mean statistically significant difference(p<0.05).2 筆筒樹雌雄配子體比率統(tǒng)計(jì)從圖 2-2 可以看出，經(jīng)過(guò) 5-azaC 和 SAM 處理后的筆筒樹的雌、雄配子體現(xiàn)了較大的差別，總的來(lái)說(shuō) 5-azaC 處理的是促進(jìn)雄配子體的分化，SAM 促進(jìn)雌配子體的分化。兩者處理筆筒樹，雄配子體的分化都多于對(duì)照組為 100μM 的 5-azaC 處理下的筆筒樹表現(xiàn)得非常明顯，高達(dá) 48.3％，10μ的雄配子體比率也要高于其他處理和對(duì)照，達(dá)到了 39.3%。SAM 處理下配子體比率也要高于對(duì)照組，但沒(méi)有達(dá)到 5-azaC 處理下的雄配子體的程M 和 100μM SAM 處理的雄配子體比率分別達(dá)到 25.9%和 24.4%。在 5-azaC 處理下的筆筒樹雄配子體的分化與雌配子體的差別非常明顯，的分化高于雌配子體的分化，在濃度為 10μM 處理時(shí)的雄配子體比雌配化高出 4 倍；濃度為 100μM 時(shí)雌配子體的分化還不到 4%，但是雄配子

圖 2-2 不同處理下筆筒樹性別分化比率注：不同字母代表其在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異（p<0.05）Fig.2-2 The sex differentiation rate of Sphaeropteris lepifera under different treatmentsNote: different letters mean statistically significant difference(p<0.05)2.3.3 筆筒樹性器數(shù)目統(tǒng)計(jì)如圖 2-3，在 5-azaC 處理下，雄配子體中精子器的數(shù)目要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于 SAM 處理和對(duì)照組。10μM 處理下筆筒樹雄配子體中精子器的平均數(shù)目達(dá)到了 162.7；100μM處理下筆筒樹雄配子體中精子器的平均數(shù)目則達(dá)到了 124.3。而 5-azaC 處理下雌配子體中頸卵器的數(shù)目與對(duì)照組沒(méi)有差別。在 SAM 處理下，筆筒樹雄配子體中精子器的數(shù)目均與對(duì)照組沒(méi)有明顯差異；雌配子體中頸卵器的數(shù)目略高于對(duì)照組和5-azaC 處理組。

圖 2-2 不同處理下筆筒樹性別分化比率注：不同字母代表其在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異（p<0.05）Fig.2-2 The sex differentiation rate of Sphaeropteris lepifera under different treatmentsNote: different letters mean statistically significant difference(p<0.05)2.3.3 筆筒樹性器數(shù)目統(tǒng)計(jì)如圖 2-3，在 5-azaC 處理下，雄配子體中精子器的數(shù)目要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于 SAM 處理和對(duì)照組。10μM 處理下筆筒樹雄配子體中精子器的平均數(shù)目達(dá)到了 162.7；100μM處理下筆筒樹雄配子體中精子器的平均數(shù)目則達(dá)到了 124.3。而 5-azaC 處理下雌配子體中頸卵器的數(shù)目與對(duì)照組沒(méi)有差別。在 SAM 處理下，筆筒樹雄配子體中精子器的數(shù)目均與對(duì)照組沒(méi)有明顯差異；雌配子體中頸卵器的數(shù)目略高于對(duì)照組和5-azaC 處理組。

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