本實驗室前期以缺水處理的馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)葉片為材料,構建了轉錄子消減cDNA文庫,文庫篩選及表達分析,識別了馬鈴薯缺水響應基因StATX-3,并克隆了其全長cDNA。檢索馬鈴薯基因組數(shù)據庫發(fā)現(xiàn),StATX-3位于第10號染色體,依據其序列相似性,注釋StATX-3為馬鈴薯ataxin-3(DMP400033234)。檢索文獻數(shù)據庫,未見植物ataxin-3功能的研究報道,故其在缺水脅迫中的作用有待證明�；诖�,本研究擬通過亞克隆,構建反義StATX-3cDNA表達載體,轉化反義StATX-3cDNA于本氏煙體內表達,篩選抑制本氏煙ataxin-3表達的轉化株系,測定和分析其生理表型和蛋白組表達譜變化,確定StATX-3參與的代謝途徑。研究結果如下:(1)利用pC-35S和pG-StATX-3載體,亞克隆構建了反義StATX-3 cDNA重組載體pC-35S-StATX-3。通過農桿菌遺傳轉化途徑,將目的重組基因轉入本氏煙(Nicotianatabacum L.)體內,依據同源基因mRNA和ataxin-3積累測定結果,篩選獲得了 ataxin-3積累極顯著減少(p0.01)的轉化株系stax-1和stax-7。(2)葉片生理表型測定結果顯示,stax-1和stax-7兩株系ATP含量顯著高于野生型對照(p0.05),表明抑制本氏煙ataxin-3表達,提高了 ATP積累。同時,stax-1和stax-7葉片葉綠素含量極顯著高于對照(p0.01),表明抑制本氏煙ataxin-3表達,促進葉綠素積累。(3)根據兩個陽性株系葉片同位素標記相對和絕對定量(iTRAQ)分析結果,識別了168個表達量倍數(shù)變化的差異豐度蛋白(Differential abundance protein species,DAPs)。通過GO功能分類和KEGG途徑富集分析,確定了這些DAPs主要參與氧化磷酸化和萜類代謝等途徑。其中,發(fā)現(xiàn)兩個光合磷酸化ATP合成酶ATPF和ATPE表達倍數(shù)極顯著增加(p0.01),表明抑制本氏煙ataxin-3表達,可提高光合磷酸化ATP合成。此外,抑制本氏煙ataxin-3表達,葉綠素合成相關酶表達倍數(shù)也顯著高于對照。生理表型和蛋白質組測定分析結果表明,抑制本氏煙ataxin-3表達,增強了光合磷酸化ATP合成和萜類積累。結合能荷調控缺水響應的研究報道,推測StATX-3通過參與能荷調控響應缺水脅迫。
【學位單位】：寧夏大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：Q943.2
【部分圖文】：

圖１－２技術路線示意圖逡逑

圖２－１邐基因ＵＮＡ特異引物菌落１＞ＣＲｒｋｅｒ邐２－４，ｐＣ－３５Ｓ－６７．－１７；Ｖ－３邋ｆｉｆｅＦＣＲ切鑒定逡逑體ｐＣ－３５Ｓ－＞Ｓ’ＭＬＹ－３正確構建，將上述２．３．１邋（１）質粒，利用限制性內切酶和及Ｗ７／／Ｉ對ｐＣ－

ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ：泳道邋１－２，邋ｐＣ－３５Ｓ－ｉ’ＨｒＸ－３邋重組載體雙酶切產物；泳道邋３，ｐＣ－ＤＬ１５０００ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ）逡逑２．３．２陽性重組農桿菌篩選逡逑按照本章２．２．２描述的方法，轉化重組載體ｐＣ－３５Ｓ－＆４７Ｘ－３于根癌農桿板上挑選單菌落，用說４：／義－３特異引物ＡＸＦ和ＡＸＲ進行菌落ＰＣＲ，產物用膠電泳檢測，結果如圖２－３所示，菌落ＰＣＲ獲得了邐基因ＤＮＡ片段，預期的８５５ｂｐ—致，表明研究獲得了陽性重組根癌農桿菌ｐＣ－３５Ｓ－？ＪＬ￥－３；保存，用于其后侵染外植體，轉化反義泣于本氏煙。逡逑２０００邋——Ｉ逡逑１０００邋—■逡逑７５０邋—■逡逑５００邋—■逡逑２５０邋—■逡逑１００邋—■逡逑圖２－３重組農桿菌菌落ＰＣＲ產物電泳結果逡逑

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