發(fā)布時間：2020-09-04 20:48

　　 本實驗室前期以缺水處理的馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)葉片為材料,構(gòu)建了轉(zhuǎn)錄子消減cDNA文庫,文庫篩選及表達分析,識別了馬鈴薯缺水響應(yīng)基因StATX-3,并克隆了其全長cDNA。檢索馬鈴薯基因組數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn),StATX-3位于第10號染色體,依據(jù)其序列相似性,注釋StATX-3為馬鈴薯ataxin-3(DMP400033234)。檢索文獻數(shù)據(jù)庫,未見植物ataxin-3功能的研究報道,故其在缺水脅迫中的作用有待證明。基于此,本研究擬通過亞克隆,構(gòu)建反義StATX-3cDNA表達載體,轉(zhuǎn)化反義StATX-3cDNA于本氏煙體內(nèi)表達,篩選抑制本氏煙ataxin-3表達的轉(zhuǎn)化株系,測定和分析其生理表型和蛋白組表達譜變化,確定StATX-3參與的代謝途徑。研究結(jié)果如下:(1)利用pC-35S和pG-StATX-3載體,亞克隆構(gòu)建了反義StATX-3 cDNA重組載體pC-35S-StATX-3。通過農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化途徑,將目的重組基因轉(zhuǎn)入本氏煙(Nicotianatabacum L.)體內(nèi),依據(jù)同源基因mRNA和ataxin-3積累測定結(jié)果,篩選獲得了 ataxin-3積累極顯著減少(p0.01)的轉(zhuǎn)化株系stax-1和stax-7。(2)葉片生理表型測定結(jié)果顯示,stax-1和stax-7兩株系A(chǔ)TP含量顯著高于野生型對照(p0.05),表明抑制本氏煙ataxin-3表達,提高了 ATP積累。同時,stax-1和stax-7葉片葉綠素含量極顯著高于對照(p0.01),表明抑制本氏煙ataxin-3表達,促進葉綠素積累。(3)根據(jù)兩個陽性株系葉片同位素標記相對和絕對定量(iTRAQ)分析結(jié)果,識別了168個表達量倍數(shù)變化的差異豐度蛋白(Differential abundance protein species,DAPs)。通過GO功能分類和KEGG途徑富集分析,確定了這些DAPs主要參與氧化磷酸化和萜類代謝等途徑。其中,發(fā)現(xiàn)兩個光合磷酸化ATP合成酶ATPF和ATPE表達倍數(shù)極顯著增加(p0.01),表明抑制本氏煙ataxin-3表達,可提高光合磷酸化ATP合成。此外,抑制本氏煙ataxin-3表達,葉綠素合成相關(guān)酶表達倍數(shù)也顯著高于對照。生理表型和蛋白質(zhì)組測定分析結(jié)果表明,抑制本氏煙ataxin-3表達,增強了光合磷酸化ATP合成和萜類積累。結(jié)合能荷調(diào)控缺水響應(yīng)的研究報道,推測StATX-3通過參與能荷調(diào)控響應(yīng)缺水脅迫。
【學(xué)位單位】：寧夏大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q943.2
【部分圖文】：

圖１－２技術(shù)路線示意圖逡逑

圖２－１邐基因ＵＮＡ特異引物菌落１＞ＣＲｒｋｅｒ邐２－４，ｐＣ－３５Ｓ－６７．－１７；Ｖ－３邋ｆｉｆｅＦＣＲ切鑒定逡逑體ｐＣ－３５Ｓ－＞Ｓ’ＭＬＹ－３正確構(gòu)建，將上述２．３．１邋（１）質(zhì)粒，利用限制性內(nèi)切酶和及Ｗ７／／Ｉ對ｐＣ－

ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ：泳道邋１－２，邋ｐＣ－３５Ｓ－ｉ’ＨｒＸ－３邋重組載體雙酶切產(chǎn)物；泳道邋３，ｐＣ－ＤＬ１５０００ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ）逡逑２．３．２陽性重組農(nóng)桿菌篩選逡逑按照本章２．２．２描述的方法，轉(zhuǎn)化重組載體ｐＣ－３５Ｓ－＆４７Ｘ－３于根癌農(nóng)桿板上挑選單菌落，用說４：／義－３特異引物ＡＸＦ和ＡＸＲ進行菌落ＰＣＲ，產(chǎn)物用膠電泳檢測，結(jié)果如圖２－３所示，菌落ＰＣＲ獲得了邐基因ＤＮＡ片段，預(yù)期的８５５ｂｐ—致，表明研究獲得了陽性重組根癌農(nóng)桿菌ｐＣ－３５Ｓ－？ＪＬ￥－３；保存，用于其后侵染外植體，轉(zhuǎn)化反義泣于本氏煙。逡逑２０００邋——Ｉ逡逑１０００邋—■逡逑７５０邋—■逡逑５００邋—■逡逑２５０邋—■逡逑１００邋—■逡逑圖２－３重組農(nóng)桿菌菌落ＰＣＲ產(chǎn)物電泳結(jié)果逡逑

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本文編號：2812570