紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是世界上重要的多年生優(yōu)質(zhì)牧草,具有產(chǎn)量高、品質(zhì)好的特點(diǎn)。然而,由于全世界范圍內(nèi)干旱和鹽脅迫災(zāi)害的日益加劇,其生長(zhǎng)范圍受到嚴(yán)重限制。隨著分子育種的興起,利用生物工程技術(shù)培育適應(yīng)不良環(huán)境的新型作物,這為紫花苜蓿育種在抗旱、抗鹽方面提供了理論依據(jù)。表皮蠟質(zhì)是覆蓋在植物表面的角質(zhì)層組成部分。蠟質(zhì)的積累與防止水分散失相關(guān),有助于抗旱耐鹽。而植物蠟質(zhì)由超長(zhǎng)鏈脂肪酸(Very Long Chain Fatty,VLCFAs)和其他衍生物共同組成。在超長(zhǎng)鏈脂肪酸合成中,主要由復(fù)合酶——脂肪酰輔酶A延長(zhǎng)酶(Fatty Acyl-enzyme A)催化完成。3-酮脂酰輔酶A合成酶(3-ketoacyl-CoA synthase,KCS)作為復(fù)合酶FAE中的限速酶,在下游產(chǎn)物的合成中起關(guān)鍵作用。本文基于RACE技術(shù),從紫花苜蓿中克隆一個(gè)基因MsKCS10,從該基因功能、特性方面進(jìn)行了研究。研究結(jié)果如下:1.利用實(shí)驗(yàn)室前期基因芯片數(shù)據(jù),使用PCR方法從紫花苜蓿葉片中克隆KCS10中間片段序列。采用RACE技術(shù),擴(kuò)增該中間片段得到基因全長(zhǎng),命名為MsKCS10。測(cè)序結(jié)果表明,其基因全長(zhǎng)(gene full length)為1889bp,開放閱讀框(Open Reading Frame,ORF)共1614bp,能編碼氨基酸537個(gè),GeneBank登錄號(hào)為MK625177。序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn),該MsKCS10基因與蒺藜苜蓿KCS10基因的同源性為98.36%。利用neighbor-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,其分析表明MsKCS10基因和蒺藜苜蓿KCS10基因的同源性最高。使用實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)分析其在各組織間的表達(dá)情況,結(jié)果表明:MsKCS10主要在葉和莖中表達(dá),在根中幾乎不表達(dá)。另外,利用RT-qPCR技術(shù)分析MsKCS10基因在9個(gè)品種的紫花苜蓿地上部分的表達(dá)情況。此外,該基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)還受逆境脅迫誘導(dǎo),分析表明,在干旱條件下,MsKCS10上調(diào)較快,而在鹽脅迫下,上調(diào)緩慢。2.構(gòu)建瞬時(shí)表達(dá)載體pCAMBIA1300-MsKCS-GFP,使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法注射在煙草葉片上進(jìn)行亞細(xì)胞定位研究,結(jié)果表明,該基因定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上;構(gòu)建過表達(dá)載體pCAMBIA1301-MsKCS,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)及葉盤法,侵染煙草,組培后經(jīng)檢測(cè)成功獲得MsKCS10過表達(dá)煙草。過表達(dá)植株經(jīng)自然光干旱脅迫、補(bǔ)充光照干旱和鹽脅迫后,其生理生化指標(biāo)均優(yōu)于對(duì)照組。此外,在煙草葉片中過表達(dá)MsKCS10,發(fā)現(xiàn)直鏈烷烴含量和脂肪酸含量增加。且直鏈烷烴含量的增加主要集中在C31和C33烷烴;脂肪酸含量的增加集中在C20和C22脂肪酸,說明MsKCS10參與煙草蠟質(zhì)合成,并參與脫羰途徑。掃描電鏡結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因煙草葉片上出現(xiàn)特殊形態(tài)的螺旋狀蠟質(zhì)晶體。葉綠素浸出試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,轉(zhuǎn)基因煙草葉綠素浸出速率小于對(duì)照組。同時(shí)葉片失水速率試驗(yàn)測(cè)定表明,轉(zhuǎn)基因煙草葉片的保水能力優(yōu)于對(duì)照組3.基于GenBank果實(shí)特異性啟動(dòng)子PG基因的啟動(dòng)子區(qū)域設(shè)計(jì)特異引物,從Monkey-Maker番茄基因組中克隆番茄果實(shí)特異性啟動(dòng)子PG,構(gòu)建果實(shí)特異啟動(dòng)子過表達(dá)載體PBI121-PG promoter-MsKCS,使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入Micro-Tom番茄中,經(jīng)植物組織培養(yǎng)和PCR檢驗(yàn),獲得MsKCS10轉(zhuǎn)基因番茄。試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因Micro-Tom番茄較對(duì)照組更耐存放。轉(zhuǎn)基因番茄果皮蠟質(zhì)的直鏈烷烴及脂肪酸和醛類物質(zhì)增加。說明MsKCS10在轉(zhuǎn)基因的番茄果實(shí)表皮的蠟質(zhì)合成中,與在煙草葉片中一樣,均參與脫羰途徑。此外經(jīng)電鏡掃描后發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因番茄表皮出現(xiàn)同轉(zhuǎn)基因煙草葉片表皮相同的特殊蠟質(zhì)晶體,這可能是由于直鏈烷烴及脂肪酸含量增加的共同作用;4.使用In-fusion構(gòu)建過表達(dá)載體pCABIAM3301-MsKCS和采用Gateway方法構(gòu)建得到干擾載體pK7GWIWG2-MsKCS。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,經(jīng)組織培養(yǎng)和檢測(cè),獲得MsKCS10過表達(dá)紫花苜蓿和MsKCS10-RNAi干擾紫花苜蓿。對(duì)MsKCS10過表達(dá)紫花苜蓿和MsKCS10-RNAi干擾紫花苜蓿進(jìn)行電鏡掃描后發(fā)現(xiàn),過表達(dá)苜蓿葉片表皮蠟質(zhì)晶體有更濃密的片狀蠟質(zhì)結(jié)晶,干擾紫花苜蓿具有較稀疏的片狀蠟質(zhì)結(jié)晶。此外,過表達(dá)MsKCS10基因苜蓿有更高的C30醇含量、直鏈烷烴含量;RNAi-MsKCS10轉(zhuǎn)基因苜蓿則表現(xiàn)出下降的C30醇含量、直鏈烷烴含量,說明MsKCS10在轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿葉片的蠟質(zhì)合成中,既參與脫羰途徑又參與�；�原途徑。綜上所述,MsKCS10主要響應(yīng)植物干旱脅迫,并且在轉(zhuǎn)基因煙草葉片和番茄果實(shí)表皮的蠟質(zhì)合成中,均參與脫羰途徑。另外,在轉(zhuǎn)基因煙草和轉(zhuǎn)基因番茄果皮都出現(xiàn)螺旋狀蠟質(zhì)晶體沉淀,結(jié)合二者蠟質(zhì)組分,這可能是由于直鏈烷烴及脂肪酸含量增加的共同作用。而MsKCS10在轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿葉片的蠟質(zhì)合成中,既參與脫羰途徑又參與�；�原途徑。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S541.9;Q943.2
【部分圖文】：

6圖 1-1 表皮蠟晶體的主要類型示意圖.re 1-1 The schematic drawing of the main types of plant epicuticular wB，殼狀型；1C，裂紋型；1D，顆粒型；1E，小板型；1F，膜狀角狀棒狀；2C，多邊形棒狀；2D，盤繞棒狀；2E，橫向脊型棒醇管狀；3B，二酮管狀；3C，花狀小板型；3D，平行小板狀；小板狀；3F，縱向棒狀 (Barthlott et al. 1998)

技術(shù)路線

X（https://blast.ncbi.nlm.neb.expasy.org/compute_p樹；使用 ProtScale（htt 性 / 疏 水 性 bin/npsa_automat.pl?page=tps://www.swissmodel.exp，驗(yàn)證其是否為 KCS 基因 質(zhì)量檢查al RNA使用酶標(biāo)儀測(cè)定O，無蛋白污染。經(jīng) 1.0%A 可用于后續(xù)反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 劉雨詩;紫花苜蓿3-酮酰輔酶A合成酶基因（MsKCS10）的克隆與功能分析[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2019年

本文編號(hào)：2811415