毛囊是控制毛發(fā)生長的皮膚附屬器官,經過周期性的結構改變可以實現自我更新。成熟的毛囊結構復雜,包含角質形成細胞、黑色素細胞及毛乳頭細胞(dermal papilla cells,DPCs)等。DPCs由起源于真皮間質的成纖維細胞高度特化而成,在毛囊的周期改變中起到關鍵作用,即使是體外傳代培養(yǎng)的DPCs仍可以繼續(xù)誘導毛囊形成,促進毛囊生長。圍繞DPCs外層的脂肪間充質干細胞(adipose derived stem cells,ADSCs)可以優(yōu)化毛V⑽⒒肪炒俳玍⑸�。ADSCs起源于中胚層,具有多向分化潛能,由于其來源豐富、免疫原性低,近年來在細胞治療和組織工程方面具有廣泛的應用前景。氧氣是干細胞微環(huán)境的重要組成成分,干細胞生存、維持和行為均離不開氧氣的調節(jié)。低氧微環(huán)境對于促進ADSCs增殖、保持其正常形態(tài)和多向分化潛能有重要影響。因此,利用低氧微環(huán)境培養(yǎng)ADSCs可以促進毛囊生長。然而這一過程具體涉及哪些分子機制目前尚不清楚,因此深入研究低氧微環(huán)境下ADSCs對毛囊生長的促進機制具有非常重要的理論意義。本研究以阿爾巴斯白絨山羊DPCs和ADSCs為研究對象,首先建立ADSCs低氧微環(huán)境,研究低氧微環(huán)境下ADSCs功能的變化。進一步收集ADSCs條件培養(yǎng)基培養(yǎng)DPCs,觀察DPCs生長的變化,并且探究相關生長因子的表達機制,從而為研究毛囊生長原理及其分子機制提供實驗依據。一、低氧微環(huán)境的建立及其對脂肪間充質干細胞功能的影響為了建立ADSCs低氧微環(huán)境,本研究首先檢測不同濃度低氧模擬物去鐵胺(desferrioxamine,DFO)和氯化鈷(cobalt chloride,CoCL_2)作用24 h、48 h和72 h對ADSCs增殖活性的影響。結果發(fā)現25μM DFO和150μM CoCl_2培養(yǎng)ADSCs 48 h的增殖活性最強,因此選擇此濃度與時間作為最佳處理條件。與此同時對細胞進行物理低氧培養(yǎng),與未處理常氧培養(yǎng)的ADSCs比較發(fā)現,無論物理低氧培養(yǎng)還是低氧模擬物培養(yǎng)均提高了ADSCs的增殖活性。鑒定低氧微環(huán)境中低氧誘導因子(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1)的表達發(fā)現,連續(xù)低氧培養(yǎng)24 h、48 h和72h后HIF-1α均有表達,其中48 h表達最高。此外,低氧培養(yǎng)后ADSCs表面標記基因CD44、CD90表達呈陽性,造血干細胞標記基因CD34和CD45表達呈陰性;多能性基因NANOG、OCT4和SOX2不僅在低氧培養(yǎng)后持續(xù)表達,而且每個基因的表達量均有提高。與此同時,在物理低氧組中,增殖基因TERT表達增加,促進細胞增殖;抑癌基因p53表達減少,凋亡基因Bcl-2/BAX比例增加,抑制細胞凋亡。以建立好的物理低氧模型為實驗對象,檢測低氧對ADSCs細胞功能的影響,包括細胞遷移能力、成血管能力以及旁分泌水平。結果顯示:低氧微環(huán)境下ADSCs的細胞遷移能力更強;在基質膠的作用下,體外培養(yǎng)ADSCs可以形成血管樣結構,且無論是單位面積的血管數量還是長度,低氧培養(yǎng)均顯著高于常氧培養(yǎng);此外,低氧條件培養(yǎng)基(hypoxic conditioned medium,Hypo-cm)中含有更多的生長因子VEGF、bFGF和PDGF。二、脂肪間充質干細胞條件培養(yǎng)基對毛乳頭細胞生長的影響使用Hypo-cm和常氧條件培養(yǎng)基(normoxic conditioned medium,Nor-cm)培養(yǎng)初級毛乳頭細胞(primary hair follicle dermal papilla cells,PHF-DPCs)和次級毛乳頭細胞(secondary hair follicle dermal papilla cells,SHF-DPCs)發(fā)現,條件培養(yǎng)基特別是Hypo-cm可以顯著提高PHF-DPCs和SHF-DPCs的增殖能力,除了EdU陽性細胞率較高外,細胞增殖基因Ki67的表達量也明顯高于對照組。細胞周期檢測結果顯示,使用條件培養(yǎng)基后,進入S期細胞比例明顯增多,且周期蛋白CDK2表達增加;此外,細胞凋亡比例減少。這證明條件培養(yǎng)基可以提高PHF-DPCs和SHF-DPCs的增殖活性。PHF-DPCs和SHF-DPCs特異性標志基因ALP檢測結果顯示,使用條件培養(yǎng)基后,ALP染色情況及活性明顯高于對照組。其他特異性標志基因SOX2、α-SMA、NCAM和Version的檢測結果顯示,使用條件培養(yǎng)基后,特別是Hypo-cm可以提高這些基因的表達。這同樣證明了條件培養(yǎng)基可以促進PHF-DPCs和SHF-DPCs的生長,增強其毛囊誘導能力。三、ERK1/2信號通路及HIF-1α調控ADSCs促進DPCs生長的機制通過檢測ADSCs分泌生長因子VEGF、bFGF和PDGF所涉及的調控網絡發(fā)現,低氧微環(huán)境會激活ADSCs ERK1/2信號通路,使用ERK1/2抑制劑PD98059處理ADSCs時,會使低氧微環(huán)境下提高的生長因子表達降低,這表明ERK1/2誘導了VEGF、bFGF和PDGF的表達。與此同時,HIF-1α在低氧微環(huán)境下發(fā)揮重要作用,一方面HIF-1α會提高ADSCs中VEGF、bFGF和PDGF表達,且這種提高受到HIF-1α抑制劑YC-1抑制。另一方面,HIF-1α會抑制ADSCs中BMP2、BMP4和BMP7表達,其中BMP7在過表達HIF-1α后顯著降低,而在添加YC-1后得到恢復。進一步構建HIF-1α表達載體PcDNA3.1-HIF-1α與BMP7啟動子熒光素酶報告載體pGL4.1-BMP7,檢測發(fā)現HIF-1α轉錄因子對BMP7啟動子活性有明顯的抑制作用,從而負性調控BMP7表達。綜上所述,本研究揭示了低氧微環(huán)境具有提高ADSCs增殖能力、加強ADSCs細胞功能的作用。使用ADSCs條件培養(yǎng)基特別是Hypo-cm可以促進DPCs生長、提高DPCs特異性標志基因的表達。ERK1/2信號通路和HIF-1α共同參與調控了低氧微環(huán)境下ADSCs對DPCs生長的促進機制。上述結果對于理解毛囊發(fā)育及其再生機理具有重要的理論和現實意義。
【學位單位】：內蒙古大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：Q952
【部分圖文】：

圖 1.1 胚胎早期毛囊的發(fā)育[6]Fig 1.1 Early embryonic development of hair follicle1.2 毛囊生長過程中的信號分子

圖 1.2 毛囊的生長周期[6]Fig 1.2 The growth cycle of hair follicle在移植手術中，毛囊形成效率與 DPCs 誘導毛囊再生的能力相關[21]。在皮膚重建和傷口愈合中，DPCs 不僅保留了形成新的 DPCs 能力，還能促進真皮鞘細

23圖 1.3 調節(jié) HIF-1 活性和穩(wěn)定性的機制[60]Fig 1.3 The mechanism for modulating HIF-1 stability and activity

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本文編號：2811374