發(fā)布時(shí)間：2020-09-03 11:31

　　 毛囊是控制毛發(fā)生長(zhǎng)的皮膚附屬器官,經(jīng)過(guò)周期性的結(jié)構(gòu)改變可以實(shí)現(xiàn)自我更新。成熟的毛囊結(jié)構(gòu)復(fù)雜,包含角質(zhì)形成細(xì)胞、黑色素細(xì)胞及毛乳頭細(xì)胞(dermal papilla cells,DPCs)等。DPCs由起源于真皮間質(zhì)的成纖維細(xì)胞高度特化而成,在毛囊的周期改變中起到關(guān)鍵作用,即使是體外傳代培養(yǎng)的DPCs仍可以繼續(xù)誘導(dǎo)毛囊形成,促進(jìn)毛囊生長(zhǎng)。圍繞DPCs外層的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose derived stem cells,ADSCs)可以優(yōu)化毛V⑽⒒肪炒俳玍⑸�。ADSCs起源于中胚層,具有多向分化潛能,由于其來(lái)源豐富、免疫原性低,近年來(lái)在細(xì)胞治療和組織工程方面具有廣泛的應(yīng)用前景。氧氣是干細(xì)胞微環(huán)境的重要組成成分,干細(xì)胞生存、維持和行為均離不開氧氣的調(diào)節(jié)。低氧微環(huán)境對(duì)于促進(jìn)ADSCs增殖、保持其正常形態(tài)和多向分化潛能有重要影響。因此,利用低氧微環(huán)境培養(yǎng)ADSCs可以促進(jìn)毛囊生長(zhǎng)。然而這一過(guò)程具體涉及哪些分子機(jī)制目前尚不清楚,因此深入研究低氧微環(huán)境下ADSCs對(duì)毛囊生長(zhǎng)的促進(jìn)機(jī)制具有非常重要的理論意義。本研究以阿爾巴斯白絨山羊DPCs和ADSCs為研究對(duì)象,首先建立ADSCs低氧微環(huán)境,研究低氧微環(huán)境下ADSCs功能的變化。進(jìn)一步收集ADSCs條件培養(yǎng)基培養(yǎng)DPCs,觀察DPCs生長(zhǎng)的變化,并且探究相關(guān)生長(zhǎng)因子的表達(dá)機(jī)制,從而為研究毛囊生長(zhǎng)原理及其分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。一、低氧微環(huán)境的建立及其對(duì)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞功能的影響為了建立ADSCs低氧微環(huán)境,本研究首先檢測(cè)不同濃度低氧模擬物去鐵胺(desferrioxamine,DFO)和氯化鈷(cobalt chloride,CoCL_2)作用24 h、48 h和72 h對(duì)ADSCs增殖活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)25μM DFO和150μM CoCl_2培養(yǎng)ADSCs 48 h的增殖活性最強(qiáng),因此選擇此濃度與時(shí)間作為最佳處理?xiàng)l件。與此同時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行物理低氧培養(yǎng),與未處理常氧培養(yǎng)的ADSCs比較發(fā)現(xiàn),無(wú)論物理低氧培養(yǎng)還是低氧模擬物培養(yǎng)均提高了ADSCs的增殖活性。鑒定低氧微環(huán)境中低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1)的表達(dá)發(fā)現(xiàn),連續(xù)低氧培養(yǎng)24 h、48 h和72h后HIF-1α均有表達(dá),其中48 h表達(dá)最高。此外,低氧培養(yǎng)后ADSCs表面標(biāo)記基因CD44、CD90表達(dá)呈陽(yáng)性,造血干細(xì)胞標(biāo)記基因CD34和CD45表達(dá)呈陰性;多能性基因NANOG、OCT4和SOX2不僅在低氧培養(yǎng)后持續(xù)表達(dá),而且每個(gè)基因的表達(dá)量均有提高。與此同時(shí),在物理低氧組中,增殖基因TERT表達(dá)增加,促進(jìn)細(xì)胞增殖;抑癌基因p53表達(dá)減少,凋亡基因Bcl-2/BAX比例增加,抑制細(xì)胞凋亡。以建立好的物理低氧模型為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,檢測(cè)低氧對(duì)ADSCs細(xì)胞功能的影響,包括細(xì)胞遷移能力、成血管能力以及旁分泌水平。結(jié)果顯示:低氧微環(huán)境下ADSCs的細(xì)胞遷移能力更強(qiáng);在基質(zhì)膠的作用下,體外培養(yǎng)ADSCs可以形成血管樣結(jié)構(gòu),且無(wú)論是單位面積的血管數(shù)量還是長(zhǎng)度,低氧培養(yǎng)均顯著高于常氧培養(yǎng);此外,低氧條件培養(yǎng)基(hypoxic conditioned medium,Hypo-cm)中含有更多的生長(zhǎng)因子VEGF、bFGF和PDGF。二、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)毛乳頭細(xì)胞生長(zhǎng)的影響使用Hypo-cm和常氧條件培養(yǎng)基(normoxic conditioned medium,Nor-cm)培養(yǎng)初級(jí)毛乳頭細(xì)胞(primary hair follicle dermal papilla cells,PHF-DPCs)和次級(jí)毛乳頭細(xì)胞(secondary hair follicle dermal papilla cells,SHF-DPCs)發(fā)現(xiàn),條件培養(yǎng)基特別是Hypo-cm可以顯著提高PHF-DPCs和SHF-DPCs的增殖能力,除了EdU陽(yáng)性細(xì)胞率較高外,細(xì)胞增殖基因Ki67的表達(dá)量也明顯高于對(duì)照組。細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示,使用條件培養(yǎng)基后,進(jìn)入S期細(xì)胞比例明顯增多,且周期蛋白CDK2表達(dá)增加;此外,細(xì)胞凋亡比例減少。這證明條件培養(yǎng)基可以提高PHF-DPCs和SHF-DPCs的增殖活性。PHF-DPCs和SHF-DPCs特異性標(biāo)志基因ALP檢測(cè)結(jié)果顯示,使用條件培養(yǎng)基后,ALP染色情況及活性明顯高于對(duì)照組。其他特異性標(biāo)志基因SOX2、α-SMA、NCAM和Version的檢測(cè)結(jié)果顯示,使用條件培養(yǎng)基后,特別是Hypo-cm可以提高這些基因的表達(dá)。這同樣證明了條件培養(yǎng)基可以促進(jìn)PHF-DPCs和SHF-DPCs的生長(zhǎng),增強(qiáng)其毛囊誘導(dǎo)能力。三、ERK1/2信號(hào)通路及HIF-1α調(diào)控ADSCs促進(jìn)DPCs生長(zhǎng)的機(jī)制通過(guò)檢測(cè)ADSCs分泌生長(zhǎng)因子VEGF、bFGF和PDGF所涉及的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn),低氧微環(huán)境會(huì)激活A(yù)DSCs ERK1/2信號(hào)通路,使用ERK1/2抑制劑PD98059處理ADSCs時(shí),會(huì)使低氧微環(huán)境下提高的生長(zhǎng)因子表達(dá)降低,這表明ERK1/2誘導(dǎo)了VEGF、bFGF和PDGF的表達(dá)。與此同時(shí),HIF-1α在低氧微環(huán)境下發(fā)揮重要作用,一方面HIF-1α?xí)岣逜DSCs中VEGF、bFGF和PDGF表達(dá),且這種提高受到HIF-1α抑制劑YC-1抑制。另一方面,HIF-1α?xí)种艫DSCs中BMP2、BMP4和BMP7表達(dá),其中BMP7在過(guò)表達(dá)HIF-1α后顯著降低,而在添加YC-1后得到恢復(fù)。進(jìn)一步構(gòu)建HIF-1α表達(dá)載體PcDNA3.1-HIF-1α與BMP7啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告載體pGL4.1-BMP7,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HIF-1α轉(zhuǎn)錄因子對(duì)BMP7啟動(dòng)子活性有明顯的抑制作用,從而負(fù)性調(diào)控BMP7表達(dá)。綜上所述,本研究揭示了低氧微環(huán)境具有提高ADSCs增殖能力、加強(qiáng)ADSCs細(xì)胞功能的作用。使用ADSCs條件培養(yǎng)基特別是Hypo-cm可以促進(jìn)DPCs生長(zhǎng)、提高DPCs特異性標(biāo)志基因的表達(dá)。ERK1/2信號(hào)通路和HIF-1α共同參與調(diào)控了低氧微環(huán)境下ADSCs對(duì)DPCs生長(zhǎng)的促進(jìn)機(jī)制。上述結(jié)果對(duì)于理解毛囊發(fā)育及其再生機(jī)理具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。
【學(xué)位單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q952
【部分圖文】：

圖 1.1 胚胎早期毛囊的發(fā)育[6]Fig 1.1 Early embryonic development of hair follicle1.2 毛囊生長(zhǎng)過(guò)程中的信號(hào)分子

圖 1.2 毛囊的生長(zhǎng)周期[6]Fig 1.2 The growth cycle of hair follicle在移植手術(shù)中，毛囊形成效率與 DPCs 誘導(dǎo)毛囊再生的能力相關(guān)[21]。在皮膚重建和傷口愈合中，DPCs 不僅保留了形成新的 DPCs 能力，還能促進(jìn)真皮鞘細(xì)

23圖 1.3 調(diào)節(jié) HIF-1 活性和穩(wěn)定性的機(jī)制[60]Fig 1.3 The mechanism for modulating HIF-1 stability and activity

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 李明紅;高鈺琪;袁志兵;孟民杰;;白藜蘆醇對(duì)低氧內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響及機(jī)制研究[J];時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥;2016年06期

2 閆琳;王龍梅;楊俠;董曉光;徐海峰;;低氧對(duì)小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞-5中根蛋白表達(dá)的影響[J];眼科新進(jìn)展;2014年05期

3 尉曉娜;謝于鵬;夏譽(yù);何金彩;;低氧對(duì)小鼠曠場(chǎng)行為的影響[J];溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2012年01期

4 劉海霞;李道季;高磊;王偉偉;陳煒清;;長(zhǎng)江口夏季低氧區(qū)形成及加劇的成因分析[J];海洋科學(xué)進(jìn)展;2012年02期

5 王茹;;低氧運(yùn)動(dòng)/訓(xùn)練研究新動(dòng)向[J];北京體育大學(xué)學(xué)報(bào);2012年08期

6 孫衍偉;曾琴琴;侯仕彩;丁兆軍;周嘉云;安永恒;孟令新;;高-低氧放療與低氧放療對(duì)食管癌療效的對(duì)比研究[J];中華全科醫(yī)學(xué);2011年10期

7 周q

本文編號(hào)：2811374