環(huán)鳥苷二磷酸(c-di-GMP)是廣泛存在于細菌中一種重要的第二信使分子,在銅綠假單胞菌中,主要參與細菌的運動粘附行為及生物被膜形成的調節(jié)。隨著合成生物學特別是光響應系統(tǒng)的發(fā)展,以環(huán)鳥苷二磷酸為對象的相關應用型研究也越來越多。本文的第一部分主要以環(huán)鳥苷二磷酸為對象,通過設計構造了單色光響應和雙色光響應兩套系統(tǒng),在利用單色光響應系統(tǒng)實現(xiàn)對單細菌的追蹤操縱后,通過進一步的優(yōu)化并建立雙色光響應系統(tǒng),利用靜態(tài)圖案化投影技術,經(jīng)過對實驗體系、實驗條件的不斷優(yōu)化測試,最終實現(xiàn)了活細菌生物被膜的可逆定向生物打印。由于工程菌種具有很強的可改造性,光響應系統(tǒng)的建立為研究新型抗菌表面、新型活細菌生物材料及其他應用領域提供了新的方法和思路。而本文的第二部分主要基于三色熒光報告系統(tǒng)設計了一套精準定量細胞內(nèi)同源重組發(fā)生概率的新方法,即三色熒光成像重組率計算系統(tǒng)(Three-color Fluoresencent Proteins based Recombination Rate Calculator System,TFPRRCS),經(jīng)過聚合酶鏈式反應(PCR)以及進一步測序的方法驗證了該系統(tǒng)的準確性。利用該系統(tǒng)建立的新方法,可以快速準確地定量細胞內(nèi)同源重組發(fā)生的概率,通過對16組重組相關的突變株重組率的定量,發(fā)現(xiàn)recA基因的缺失顯著降低了銅綠假單胞菌中同源重組發(fā)生概率,而uvrD和radA基因的缺失則顯著地提升了銅綠假單胞菌中同源重組發(fā)生概率,但uvrDrecA和radArecA基因雙缺失則將銅綠假單胞菌中同源重組發(fā)生概率拉回到較低水平。同時,利用該方法表征了銅綠假單胞菌中不同生理條件下的同源重組發(fā)生概率,發(fā)現(xiàn)環(huán)丙沙星可以顯著地提高銅綠假單胞菌內(nèi)同源發(fā)生概率,提高胞內(nèi)c-di-GMP水平也同樣能顯著地提高銅綠假單胞菌內(nèi)同源發(fā)生概率。另外,利用該方法探究不同基因組結構對重組率的影響,發(fā)現(xiàn)在相同同源臂間距下,同源臂的序列長度越長,重組發(fā)生的概率則越高,在一定區(qū)間內(nèi),同源臂長度和重組率大小成指數(shù)關系,但是同源臂長度小于或大于一定數(shù)值時這種相關性則消失,通過建模完美地擬合了同源臂長度和重組率大小之間的關系,發(fā)現(xiàn)DNA同源重組過程中的鏈交換過程是由熵驅動的,并且鏈交換的過程對堿基錯配的容忍度很低,而不同同源臂間隔、不同基因組插入位置、不同培養(yǎng)時間以及不同啟動子等條件對重組率的影響都沒有顯著性差異。
【學位單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：Q93
【部分圖文】：

第一章 緒論1.1 細菌的第二信使：環(huán)鳥苷二磷酸所謂第二信使分子是指細胞內(nèi)通過信號分子自身濃度的變化來應答胞外信號導影響胞內(nèi)受體的一類非蛋白類小分子。真核生物中的第二信使包括環(huán)腺苷cAMP）、環(huán)鳥苷酸（cGMP）、1,2-二酰甘油（DAG）、1,4,5-三磷酸肌醇（IP3）離子等，而原核生物的第二信使包括環(huán)腺苷酸（cAMP）、鈣離子、環(huán)二腺苷c-di-AMP）以及本文的研究對象環(huán)鳥苷二磷酸（c-di-GMP）等[1]。環(huán)鳥苷二磷兩個 GTP 分子經(jīng)二鳥苷酸環(huán)化酶環(huán)化而成，如圖 1.1 所示[2]，也可被磷酸二酯解成 pGpG 或者分解成 GMP 單核苷酸。研究表明，c-di-GMP 參與調解多種生程，包括細菌的運動黏附行為、生物被膜的形成及其致病性等，其相關研究對被膜的防治和抗生素耐藥等[3]問題具有重要意義。

般都具有合成 c-di-GMP 的能力，除此之外，部分二鳥苷酸環(huán)化酶還具有其他生功能。例如，在新月柄桿菌（C.crescentus）中，二鳥苷酸環(huán)化酶還參與到細胞的調控中。新月柄桿菌分裂時，具有 GGDEF 和 EAL 結構域的蛋白被分開至細兩極，比如二鳥苷酸環(huán)化酶 PleD 則定位至新月柄桿菌的葉柄狀一極，合-di-GMP 關閉鞭毛的運動馬達、抑制細菌的運動，直至新的基因組復制周期的開1]。磷酸二酯酶可以斷裂磷酸二酯鍵，通常包括磷酸二酯酶 C 和磷酸二酯酶 D、素、鞘磷脂磷酸二酯酶、DNA 酶、RNA 酶和限制性內(nèi)切酶等，但磷酸二酯酶熟功能還是分解 cAMP、cGMP 和 c-di-GMP 等。磷酸二酯酶通常包含 EAL 或D-GYP 結構域，能夠將 c-di-GMP 分解成 pGpG 或者 GMP，例如銅綠假單胞菌包含有 21 個 EAL 結構域蛋白[12]。研究表明，Mg2+和 Mn2+在 c-di-GMP 的分解不可少，Zn2+和 Ca2+則可以抑制該水解過程，而 EAL 結構域中的 Glu 同樣對水活性是必須的，因為 E 至 A 的突變是可以使該水解活性失活[13, 14]。

1.1.2 環(huán)鳥苷二磷酸的作用機理環(huán)鳥苷二磷酸參與調控多種細胞功能，主要通過核糖開關[15]、轉錄調節(jié)因子[16]、包含 PliZ結構域蛋白[17-19]和退化的 GGDEF 或 EAL結構域蛋白[20]等來實現(xiàn)對下游基因的調控。C-di-GMP 參與細胞功能的調控則主要通過與特定蛋白結合的形式來完成對下游基因的調控。例如 c-di-GMP 調節(jié)細菌纖維素合成時，能夠結合包含 PliZ 結構域的 BcsA 蛋白來激活 BcsA-BcsB 復合體，從而激活細菌纖維素合成酶活性，這表示包含 PliZ 結構域的 c-di-GMP 效應蛋白或者比如新發(fā)現(xiàn)的 YajQ 蛋白家族[21]可以作為通用的適配器來連接 c-di-GMP 信號，輸入至酶蛋白或者轉錄因子來開啟下游的表達。同時，c-di-GMP 也可以結合眾多的轉錄調節(jié)因子，包括響應調節(jié)因子或者 Crp家族蛋白等[22]。同樣地，c-di-GMP 也能夠結合來源于銅綠假單胞菌的 FleQ 蛋白的AAA+ ATP 酶結構域，或者結合組氨酸激酶，如新月柄桿菌中的 CckA 蛋白，來調節(jié)下游基因回路[23, 24]。另一方面，c-di-GMP 也可以通過核糖開關來調控下游基因的表達，Sudarsan 等發(fā)現(xiàn)在霍亂弧菌等真細菌中，c-di-GMP 可以結合 mRNA 來參與下游

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