基因編輯技術(shù)已經(jīng)成為生物學(xué)領(lǐng)域中最受歡迎的技術(shù)之一,針對基因編輯個體的篩選和鑒定的檢測方法已經(jīng)成為當(dāng)今重要的研究內(nèi)容。本研究基于實時熒光定量PCR(qPCR)平臺開發(fā)了新的檢測方法,以合成的9個質(zhì)粒為樣品材料,對qPCR方法進行靈敏度與特異性的檢測,同時綜合比較了已經(jīng)報道的T7核酸內(nèi)切酶I(T7E1)檢測法、臨界退火溫度PCR(ACT-PCR)檢測法和高分辨率熔解曲線(HRM)分析法。研究發(fā)現(xiàn)其它方法在時間、靈敏度、勞動力、成本以及序列的局限性,凸現(xiàn)了qPCR方法在這幾個方面的優(yōu)勢。進一步的以南粳46、編輯TGW6基因的水稻為實驗材料,利用qPCR與數(shù)字PCR的方法對基因編輯水稻樣品進行檢測與鑒定。主要研究結(jié)果如下:1.檢測qPCR方法的靈敏度與特異性,利用雙探針進行實驗,研究顯示該方法即使對于單堿基的缺失、插入和替換的DNA樣品,依舊可以準(zhǔn)確的檢測出來。對于編輯TGW6基因的水稻樣品的檢測篩選,qPCR方法可以準(zhǔn)確鑒定區(qū)分樣品類型,通過2~(-△△CT)方法計算分析大量樣本數(shù)據(jù)得到結(jié)果顯示野生型、雜合型突變和純合型突變相對應(yīng)的值為1(1.16至0.80),0.5(范圍從0.64到0.41)和0。2.利用T7E1檢測法、ACT-PCR檢測法與HRM分析法檢測鑒定9個合成質(zhì)粒的DNA樣品,T7E1檢測法進行酶切5個小時后,實驗結(jié)果良好,單堿基突變體均被剪切出兩條帶且條帶明顯。在ACT-PCR檢測法中將退火溫度設(shè)定為73℃,凝膠電泳顯示只有WT野生型出現(xiàn)條帶的,而突變體均沒有條帶。HRM分析法同樣適用于基因編輯的突變體的篩選,但是該篩選方法不能區(qū)分A-T型的單堿基替換。3.T7E1檢測法與ACT-PCR檢測法,在時間消耗上大于4小時,而HRM分析法在時間上的消耗小于2個小時。在靈敏度上與其他兩種方法相比,T7E1檢測法的靈敏度呈中等水平。ACT-PCR檢測法與T7E1檢測法因操作繁瑣,所以人力成本很高,而HRM分析法在中等水平。相比較T7E1檢測法與ACT-PCR檢測法,HRM分析法在成本花費上比較高。ACT-PCR檢測法有一定的序列局限性,而其他兩種方法沒有序列的局限性。4.利用數(shù)字PCR檢測編輯TGW6基因的水稻,進一步的將qPCR方法延伸到ddPCR平臺,擴展該方法的靈敏度,同時優(yōu)化試驗環(huán)節(jié),該方法可以成功的區(qū)分野生型、雜合型突變、純合型突變,結(jié)果目的基因/內(nèi)參基因比值分別為0.999≈1、0.512≈0.5、0.0039≈0,實現(xiàn)方法升級。
【學(xué)位單位】：沈陽師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S511;Q943.2
【部分圖文】：

水稻 TGW6 基因編輯檢測方法比較研究成，其中 32 個氨基酸都是保守的，只有第 12 位和第 13 位的氨基酸變化較大兩個氨基酸被稱為雙氨基酸殘基（Repeatvarible di-residues, RVDs），RVD 包冬酰胺—異亮氨酸（NI）、組氨酸—天冬氨酸（HD）、天冬酰胺—甘氨酸（以及天冬酰胺—天冬酰胺（NN），RVD 與堿基的對應(yīng)關(guān)系為: NI 識別 A，NGT，NN 識別 G，HD 識別 C[39-40]。每個 TALE 單體只靶向 1 個核苷酸。在構(gòu)建 TA人工酶時需要針對每一個靶位點的上下游各設(shè)計一個 TALE 識別模塊，將兩個識別模塊與 Fok I 酶結(jié)合，就完成了 TALENs 的設(shè)計。當(dāng) Fok I 酶形成二聚體活構(gòu)時就可以對靶位點進行剪切[9,41]，完成基因組編輯的實驗。TALEN 技術(shù)原理圖如圖 2。

水稻 TGW6 基因編輯檢測方法比較研究A 雙鏈的功能，而 II 型 CRISPR/Cas 免疫系統(tǒng)中，只有 1 個 Cas9 蛋白就可以A 雙鏈進行切割[45]。研究發(fā)現(xiàn) CRISPR 系統(tǒng)介導(dǎo)的免疫需要兩個 RNA，分別式激活 RNA（trans-activating cr RNA, tracr RNA）和 CRISPR 基因座轉(zhuǎn)錄出來-cr RNA。當(dāng) tracrRNA 與 pre-cr RNA 互補配對后，激活 RNAase Ⅲ并對 pre-cr R行剪切，使之成為成熟的 cr RNA[46]。成熟的 cr RNA 與 tracr RNA 形成向?qū)?RSingle guide RNA, sg RNA）的嵌合 RNA 分子，sg RNA 引導(dǎo) Cas9 蛋白在雙A 的靶位點上并在原型間隔毗鄰序列（Proto-spacer adjacent motif, PAM）的上 bp 的位置切割 DNA 序列[9,47-48]。CRISPR /Cas 9 原理示意圖[49]如圖 3。

技術(shù)路線圖

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1 王軍;楊杰;徐祥;朱金燕;范方軍;李文奇;王芳權(quán);仲維功;;水稻千粒重基因TGW6功能標(biāo)記的開發(fā)與利用[J];中國水稻科學(xué);2014年05期

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1 丁霖;水稻TGW6基因編輯檢測方法比較研究[D];沈陽師范大學(xué);2019年

本文編號：2808201