發(fā)布時(shí)間：2020-07-14 21:13

【摘要】：六堡茶是廣西有名的黑茶品種,其生產(chǎn)過程的關(guān)鍵步驟之一就是“渥堆”,此期間有大量微生物繁殖,在微生物的作用下產(chǎn)生特殊的香味及茶的各種物質(zhì)。本研究目的在于探索六堡茶中的真菌微生物及基因資源,以期將其利用到煙制品和茶葉中。研究主要內(nèi)容及結(jié)果如下:(1)菌株的篩選與鑒定:①從廣西六堡茶中分離得到四株具有潛在利用價(jià)值的真菌。通過顯微觀察微觀形態(tài)和分子鑒定結(jié)合的方法鑒定出這四株真菌所屬的物種。分別命名為:Aspergillustubingensis GYC 501(簡稱GYC 501)、Aspillls chevalieri E 2(簡稱E2)、Aspergillus chevalieri E 3(簡稱E 3)和Aspergillus cristatusE 6(簡稱E 6)。②對這些真菌進(jìn)行生理生化鑒定,發(fā)現(xiàn)這些真菌可以利用不同種類的多糖并各具特色。初步確定GYC 501具有產(chǎn)果膠酶、纖維素酶的能力;E2具有產(chǎn)淀粉酶、纖維素酶的能力;E 3具有產(chǎn)淀粉酶的能力;E 6尚未檢測到能產(chǎn)生這幾種大分子水解酶。(2)菌株的生理特性:①探索了三株散囊菌屬真菌在固體橘皮粉和固體煙粉培養(yǎng)基內(nèi)的生長情況,發(fā)現(xiàn)三株真菌在固體煙粉培養(yǎng)基中培養(yǎng)的適應(yīng)性更好。E 2無法在橘皮粉培養(yǎng)基內(nèi)生長,E 3在兩種培養(yǎng)基中生長最快。②對三株散囊菌屬真菌在液體煙梗粉培養(yǎng)基和液體茶粉培養(yǎng)基內(nèi)的生長情況進(jìn)行了探索,發(fā)現(xiàn)其在以煙梗粉為營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基內(nèi)生長更良好。同樣地,E 3在兩種培養(yǎng)基中生長最快。③對液體發(fā)酵液進(jìn)行了薄層層析分析,發(fā)現(xiàn)三株真菌在煙梗粉培養(yǎng)基中幾乎不產(chǎn)生可以被提取觀察到的物質(zhì),而在茶粉培養(yǎng)基內(nèi)都能產(chǎn)生三種在紫外光下發(fā)粉紅色光的物質(zhì)。④對液體發(fā)酵液的果膠酶、纖維素酶和淀粉酶活性進(jìn)行了考察,發(fā)現(xiàn)它們的水解酶活力都很低�？傮w來說E 6的三種酶分泌能力最高、E 3次之、E 2最差。⑤對液體發(fā)酵液的還原糖和總糖含量、氨基酸含量、總抗氧化能力、DPPH·降解能力和茶多酚含量進(jìn)行了測定,發(fā)現(xiàn):對于液體煙梗粉培養(yǎng)基,相比于對照,發(fā)酵后的培養(yǎng)基內(nèi)的總糖含量顯著下降,降幅在16.29～39.98%;還原糖含量升高,增幅在2.86～3.89倍之間;氨基酸含量減少;總抗氧化能力改變不明顯;DPPH·降解能力顯著上升;茶多酚含量上升。對于液體茶粉培養(yǎng)基,相比于對照,發(fā)酵后的培養(yǎng)基內(nèi)的總糖含量顯著上升,增幅在2.07～35.25%還原糖含量升高,增幅在131.70～627.02%之間;氨基酸含量減少,降幅在0.52～32.68%;總抗氧化能力和DPPH·降解能力顯著上升;茶多酚含量顯著上升。(3)相關(guān)酶基因的克隆與表達(dá):①從GYC 501中克隆到一個(gè)編碼聚半乳糖醛酸酶的基因pgⅡ,epgⅡ長度為1038 bp;其成功在畢赤酵母GS115中進(jìn)行了高效表達(dá)。rePGII蛋白總共由346個(gè)氨基酸殘基組成,甲醇誘導(dǎo)7 d酶活力達(dá)到5672.85±204.39 U/mL。蛋白實(shí)際大小約為38 kDa,最適反應(yīng)溫度為50℃,最適pH為5.0,其在鋅離子濃度為10 mM時(shí)酶活性是對照的2.78倍。rePGII的熱穩(wěn)定性不是太好:若以30 min內(nèi)剩余酶活力70%為穩(wěn)定,rePGII在水溶液稀釋時(shí)穩(wěn)定溫度為30℃,在含20%甘油的pH 5.0檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液稀釋時(shí)穩(wěn)定溫度為40,在pH 5.0檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液稀釋時(shí)穩(wěn)定溫度為20℃。以聚半乳糖醛酸為底物時(shí)Vmax值為1434士159.20 U/mg,Km值為4.319±0.86mg/mL。②從GYC 501中克隆到一個(gè)編碼β-葡萄糖苷酶的基因bσN,rebgN長度為1761 bp,reBGN的氨基酸殘基數(shù)為587個(gè),并成功在畢赤酵母GS115中進(jìn)行了表達(dá)。③從GYC 501中克隆到一個(gè)編碼β-葡萄糖苷酶的基因bg2E,但其在畢赤酵母GS115中沒有成功表達(dá)。④從GYC501中克隆到一個(gè)編碼內(nèi)切葡聚糖酶的基因egB,但其在畢赤酵母GS115中沒有成功表達(dá)。⑤從GYC 501中克隆到一個(gè)編碼果膠甲酯酶的基因pmeA,在畢赤酵母GS115中有少量表達(dá),并具有聚半乳糖醛酸酶活性。
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q93
【圖文】：

乳糖醛酸的ａ－１，邋４糖苷鍵連接長鏈作為主要結(jié)構(gòu)，半乳糖、鼠李糖、巖藻糖、醋酸、阿逡逑拉伯糖、木糖、葡萄糖醛酸、芹菜糖、甲酯、乙酰酯等成分以多種不同的連接方式組成逡逑其側(cè)鏈Ｉ３＇詳情見圖１－１。果膠具有水溶性，在水中以凝膠的形式存在，在酸性條件下逡逑最穩(wěn)定，是很容易分離的生物質(zhì)，分子量大約在５萬？３０萬，存在于植物細(xì)胞壁的中間逡逑層［３８１。逡逑ＲＧ－Ｉ邐ＸＧＡ邐ＨＧ邐ＲＧ－ＩＩ逡逑0邋＝邋ｌ－邋Ａｃｅｒｉｃ邋ａｃｉｄ邐▲邐＝邋Ｌ邋－Ｆｕｃｏｓｅ邐0邋＝邋Ｋｄｏ逡逑0邋＝邋ｄ邋－Ａｐｉｏｓｅ邐0邐＝邋ｄ邋－Ｇａｌａｃｔｏｓｅ邐暑＝ｌ邋－Ｒｈａｍｎｏｓｅ逡逑０邋＝Ｌ－Ａｒａｂｉｎｏｓｅ邐①…。＝邋ｄ邋－Ｘｙｌｏｓｅ逡逑ｔ邐＜｜＞邋＝邋Ｇａｌａｃｔｕｒｏｎｉｃ邋ａｃｉｄ逡逑＝邋Ｂｏｒａｔｅ邐＾邐0邋＝邋Ａｃｅｔｙｌ邋ｇｒｏｕｐｓ逡逑？邋＝Ｄ－Ｄｈａ邐Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｃ邋ａｃｉｄ邋Ｐ邋＝邋Ｍｅｔｈｙｌ邋ｇｒｏｕｐｓ邐Ｃｕｒｒｅｎｔ邋Ｏｐｉｎｉｏｎ邋ｉｎ邋Ｐｌａｎ．邋Ｂｉｏｌｏｇｙ逡逑圖１－１果膠結(jié)構(gòu)示意圖ｄ逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｓｃｈｍｅｔｉｃ邋ｐｅｃｔｉｎ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ逡逑１．２．１聚半乳糖醛酸酶逡逑因?yàn)楣z的復(fù)雜組成，果膠酶即是一類復(fù)合酶的總稱，其中最重要的一種為解聚酶逡逑（Ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ）邋［３９］

Ｔｏｐ－ｌｅｆｔ：邋Ｅ邋２邋ｏｂｖｅｒｓｅ，邋ｔｏｐ－ｒｉｇｈｔ：邋Ｅ邋２邋ｒｅｖｅｒｓｅ，邋ｍｉｄｄｌｅ－ｌｅｆｔ：邋Ｅ邋３邋ｏｂｖｅｒｓｅ？邋ｍｉｄｄｌｅ－ｒｉｇｈｔ：邋Ｅ邋３邋ｒｅｖｅｒｓｅ，邋ｂｏｔｔｏｍ－ｌｅｆｔ：邋Ｅ邋６邋ｏｂｖｅｒｓｅ．逡逑ｂｏｔｔｏｍ－ｒｉｇｈｔ：邋Ｅ邋６邋ｒｅｖｅｒｓｅ．邋Ｓｃａｌｅ邋ｂａｒ邋ｉｎｄｉｃａｔｅｓ邋２邋ｃｍ逡逑如圖２－２，在ＣＺ２０Ｓ培養(yǎng)基中三株散囊菌屬真菌生長良好，特別是Ｅ邋３。能看出（１）逡逑Ｅ２的菌絲延展性有限，有性結(jié)構(gòu)子囊果大量產(chǎn)生并且偏好聚集生長，無性結(jié)構(gòu)散生于逡逑表面，分泌的褐色色素聚集于菌落中央的菌絲體內(nèi)，同時(shí)也滲入瓊脂中。（２）邋Ｅ３的菌逡逑落顏色接近金色，產(chǎn)生大量無性結(jié)構(gòu)分生孢子梗，有性結(jié)構(gòu)少量散生，產(chǎn)生褐色色素分逡逑布在成熟的菌絲體內(nèi)，同時(shí)也滲入瓊脂中。（３）邋Ｅ６的菌落菌絲體不發(fā)達(dá)，所以其菌絲逡逑延展性差，邊緣不整齊，有性結(jié)構(gòu)子囊果零散分布，各自聚集的趨勢非常明顯，并且被逡逑１５逡逑

Ｔｏｐ－ｌｅｆｔ：邋Ｅ邋２邋ｏｂｖｅｒｓｅ，邋ｔｏｐ－ｒｉｇｈｔ：邋Ｅ邋２邋ｒｅｖｅｒｓｅ，邋ｍｉｄｄｌｅ－ｌｅｆｔ：邋Ｅ邋３邋ｏｂｖｅｒｓｅ，邋ｍｉｄｄｌｅ－ｒｉｇｈｔ：邋Ｅ邋３邋ｒｅｖｅｒｓｅ，邋ｂｏｔｔｏｍ－ｌｅｆｔ：邋Ｅ邋６邋ｏｂｖｅｒｓｅ，逡逑ｂｏｔｔｏｍ－ｒｉｇｈｔ：邋Ｅ邋６邋ｒｅｖｅｒｓｅ．邋Ｓｃａｌｅ邋ｂａｒ邋ｉｎｄｉｃａｔｅｓ邋２邋ｃｍ逡逑如圖２－３，在將蔗糖含量增加到４０％發(fā)現(xiàn)它們在菌絲延展速度、子囊果產(chǎn)生的速度逡逑和數(shù)量、色素出現(xiàn)的時(shí)間和產(chǎn)量等方面都加快或提前，所以蔗糖在其這些方面的發(fā)展起逡逑到了重要的促進(jìn)作用。（１）對于Ｅ２，相比于在ＣＺ２０Ｓ中，其菌絲延展性有了巨大提逡逑１６逡逑

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2755490