橡膠草小橡膠粒子蛋白基因及其啟動子的克隆與功能分析

發(fā)布時間：2020-06-03 08:33

【摘要】：目的:天然橡膠在國民經(jīng)濟(jì)以及科技領(lǐng)域中占有重要地位,橡膠草(Taraxacum kok-saghyz Rodin)根中所產(chǎn)橡膠質(zhì)量與巴西橡膠樹(Hevea brasiliensis)的橡膠相當(dāng),由于其生育周期較短、易于進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化等優(yōu)點(diǎn),是研究天然橡膠產(chǎn)膠機(jī)理的理想模式植物。小橡膠粒子蛋白(Small Rubber Particle Protein,SRPP)是橡膠顆粒膜蛋白中重要的組成成分,在橡膠凝固和橡膠產(chǎn)量中均起到一定作用,因此研究橡膠草SRPP基因功能,鑒定控制SRPP基因表達(dá)的調(diào)控元件,為研究天然橡膠生物合成的分子作用機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。方法:本研究以橡膠草為實(shí)驗(yàn)材料,利用熒光定量法分析TkREF/SRPPs基因家族的表達(dá)模式;以TkSRPP3基因?yàn)檠芯繉ο?分析其時空表達(dá)以及原核表達(dá)模式;利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得轉(zhuǎn)TkSRPP3基因的橡膠草植株;在橡膠草基因組數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上,克隆PTkSRPP3啟動子,利用基因工程技術(shù)構(gòu)建P0/P1/P2/P3/P4::GUS植物表達(dá)載體,通過組織化學(xué)染色法分析缺失啟動子活性;激素及傷害處理P0/P1/P2/P3/P4::GUS轉(zhuǎn)基因煙草,利用GUS酶活測定法檢測GUS報告基因表達(dá)量的變化,分析啟動子缺失元件對外界環(huán)境變化的影響。結(jié)果:(1)TkREF/SRPPs基因家族經(jīng)茉莉酸甲酯(MeJA)處理后,TkREF/SRPPs家族中TkSRPP1和TkSRPP3的表達(dá)量顯著上調(diào);經(jīng)脫落酸(ABA)處理后,TkREF/SRPPs家族中TkSRPP3的表達(dá)量顯著上調(diào);(2)克隆得到TkSRPP3基因,開放閱讀框?yàn)?90bp,編碼229個氨基酸,TkSRPP3蛋白分子質(zhì)量24.431kDa,屬于酸性蛋白,具有REF保守結(jié)構(gòu)域,是REF/SRPPs家族成員之一;系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明TkSRPP3與短角蒲公英TbSRPP3同源性較高;時空表達(dá)分析結(jié)果表明,TkSRPP3基因在六月齡的橡膠草根部組織中表達(dá)量最高;原核表達(dá)分析TkSRPP蛋白大小為24.3kDa,在濃度為1mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)6h為最佳誘導(dǎo)條件,可獲得大量蛋白;構(gòu)建pCAMBIA2300-TkSRPP3植物表達(dá)載體,成功獲得5株轉(zhuǎn)TkSRPP3基因橡膠草;(3)克隆得到PTkSRPP3啟動子,序列長度為2188bp;序列分析表明啟動子具有基礎(chǔ)的啟動子特征元件以外,還包含關(guān)于組織特異表達(dá)元件和響應(yīng)光、激素、傷害、熱等順式作用元件;構(gòu)建啟動子融合GUS報告基因的植物表達(dá)載體,組織化學(xué)染色證明啟動子具有啟動活性,不具有組織特異性;構(gòu)建P0(-2188bp)/P1(-1592bp)/P2(-1274bp)/P3(-934bp)/P4(-450bp)啟動子缺失片段融合GUS報告基因的植物表達(dá)載體,GUS染色分析顯示啟動子缺失片段均有活性,缺失啟動子活性隨著片段的截短而活性減弱;(4)利用ABA、SA(水楊酸)、MeJA和傷害處理穩(wěn)定表達(dá)GUS基因的煙草植株,GUS酶活表達(dá)量顯示:含有ABA響應(yīng)元件的P0(-2188bp)/P1(-1592bp)/P2(-1274bp)受ABA處理正調(diào)控;含有JA響應(yīng)元件的P2(-1274bp)受MeJA處理正調(diào)控;含有SA響應(yīng)元件的P1(-1592bp)/P2(-1274bp)受SA處理正調(diào)控;含有傷害響應(yīng)元件的P3(-934bp)受傷害處理正調(diào)控。結(jié)論:(1)TkREF/SRPPs基因家族響應(yīng)MeJA和ABA的表達(dá)模式各不相同,其中TkSRPP3基因同時受到兩類激素的強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá);(2)TkSRPP3基因的生物信息學(xué)分析表明TkSRPP3屬于REF/SRPPs家族,且無跨膜結(jié)構(gòu)域;TkSRPP3基因的時空表達(dá)分析顯示六月齡橡膠草根部組織中TkSRPP3的表達(dá)量最高;(3)PTkSRPP3啟動子具有啟動活性,不具有組織表達(dá)特異性;PTkSRPP3缺失啟動子中含有ABA響應(yīng)元件的P0(-2188bp)/P1(-1592bp)/P2(-1274bp)受ABA處理正調(diào)控;含有JA響應(yīng)元件的P2(-1274bp)受MeJA處理正調(diào)控;含有SA響應(yīng)元件的P1(-1592bp)/P2(-1274bp)受SA處理正調(diào)控;含有傷害響應(yīng)元件的P3(-934bp)受傷害處理正調(diào)控。
【圖文】：