發(fā)布時(shí)間：2020-06-03 09:05

【摘要】：水稻黑條矮縮病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)是呼腸孤病毒科(Reoviridae)斐濟(jì)病毒屬(Fijivirus)第二組成員,引起水稻黑條矮縮病、玉米粗縮病等。RBSDV基因組包括十條雙鏈RNA(dsRNA),5'端具有帽子結(jié)構(gòu)(m7GPPPN),3'末端沒有poly(A)尾結(jié)構(gòu),共編碼13種蛋白;其中S5、S7、S9各自編碼兩個(gè)蛋白,屬于雙順反子RNA,其余鏈?zhǔn)菃雾樂醋覴NA,各編碼一個(gè)蛋白。RBSDV基因組的10條雙鏈RNA的5'和3'末端各自存在十分保守的序列,且緊鄰5'和3'端的序列存在潛在的堿基互補(bǔ)配對。本文研究RBSDV單順反子RNA的非編碼區(qū)對翻譯的調(diào)控作用及機(jī)制;RBSDV雙順反子RNA的蛋白表達(dá)特性以及調(diào)控第二個(gè)蛋白表達(dá)的順式作用元件。利用螢火蟲熒光素酶(Fluc)報(bào)告基因載體和定點(diǎn)突變分析,探究RBSDV單順反子RNA S3和S10的的非編碼區(qū)對翻譯的調(diào)控作用及機(jī)制。結(jié)果表明:(1)S3和S10的5'UTR在有無帽子時(shí)均可以正向調(diào)控報(bào)告基因Fluc的翻譯,表現(xiàn)核糖體內(nèi)部進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)活性;且5'UTR的基因組間保守序列及鄰近序列均參與IRES活性;(2)對應(yīng)的3'UTR則抑制5'UTR對翻譯的正調(diào)控效應(yīng),其分子基礎(chǔ)是5'UTR和3'UTR之間的RNA-RNA互作;且該RNA-RNA互作也抑制帽子依賴型翻譯的效率。利用~(35)S標(biāo)記的體外翻譯體系同步分析RBSDV基因組雙順反子S7與S9分別編碼的兩個(gè)蛋白的表達(dá)情況及比例;然后利用螢火蟲熒光素酶(Fluc)報(bào)告基因載體和定點(diǎn)突變分析初步定位第二個(gè)蛋白翻譯調(diào)控的順式作用元件。結(jié)果表明:(1)S7和S9各自編碼的2個(gè)蛋白都可以從基因組表達(dá),暗示這2個(gè)雙順反子RNA的第二個(gè)蛋白的表達(dá)模式是內(nèi)部起始。S7編碼的第二個(gè)蛋白P7b的表達(dá)量約為第一個(gè)蛋白P7a的4.7%;而S9編碼的第二個(gè)蛋白P9b的表達(dá)量約為第一個(gè)蛋白P9a的18.8%;(2)S9編碼的P9a與P9b的基因間隔區(qū)(IGR)中存在2個(gè)小的ORF;由于這2個(gè)小ORF消失時(shí)P9b的蛋白表達(dá)量提高約73.4%,表明2個(gè)小ORF的存在降低了P9b的蛋白表達(dá)效率;(3)S7和S9的IGR具備弱IRES活性;且相應(yīng)的3'UTR可以協(xié)同提高IGR的IRES活性。綜合兩部分的研究結(jié)果,發(fā)現(xiàn)3'UTR在單順反子RNA的翻譯調(diào)控中起抑制作用,而在雙順反子的第二個(gè)蛋白的翻譯調(diào)控中起促進(jìn)作用。暗示3'UTR可能是雙順反子RNA調(diào)控2個(gè)蛋白表達(dá)比例的關(guān)鍵區(qū)段。
【圖文】：

1.1.4 基因組結(jié)構(gòu)及功能RBSDV 的基因組由 10 條雙鏈 RNA（dsRNA）組成，含有 13 個(gè)開放閱讀框（ORF）。按照其基因組片段由大到小的順序依次命名為 S1-S10（圖 1），其中 S1 片段最大，，大小為 4501bp，S10 最小，片段大小為 1801bp（Zhang et al.，2001；Wang et al.，2003）。據(jù)基因組序列分析結(jié)果顯示，RBSDV的10條基因組片段末端含有兩個(gè)高度保守的序列，均為5'-AAGTTTTTT……CAGCTA(G)T(C/A)T(C)GTC-3'，并且緊鄰保守序列的是7-11bp的反向重復(fù)序列（Zhang et al.，2001；Wang et al.，2003；Wei et al.，2009；Deng et al.，2012），可潛在介導(dǎo) 5'和 3'末端的遠(yuǎn)距離互作，但具體功能尚未報(bào)道。

合載體pF-RB-S3-5U和pF-RB-S10-5U（構(gòu)建策略見附表2），其各自的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（F-RB-S3-5U和F-RB-S10-5U）進(jìn)行體外翻譯反應(yīng)。測定報(bào)告基因表達(dá)量，顯示F-RB-S3-5U和F-RB-S10-5U的體外翻譯效率均為空載體F（FLuc）的5倍左右（圖2-A&B），而分別含有S3的1-104位核苷酸序列和S10的1-111位核苷酸序列的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物F-RB-S3-(1-104)、F-RB-S10-(1-111)，與只含有相應(yīng)5'UTR的體外轉(zhuǎn)錄物（F-RB-S3-5U和F-RB-S10-5U）相比，無明顯提高翻譯效率（圖2-A&B）。結(jié)果表明，RBSDV S3和S10的5'UTR含有不依賴帽子翻譯的正調(diào)控序列元件，即具備潛在的IRES活性。此外，含有5'帽子結(jié)構(gòu)的空載體Cap-F相對于不加帽的空載體F（FLuc），其翻譯效率大約提高36倍（圖2-A&B）；含有5'帽子結(jié)構(gòu)的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物Cap-F-RB-S3-5U和Cap-F-RB-S10-5U
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S432.41

【參考文獻(xiàn)】

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1 曹a\;李志英;牟紅珍;丁國平;王盛;;番茄叢矮病毒的分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J];生命科學(xué)研究;2013年03期

2 鄧金奇;戴良英;;水稻黑條矮縮病毒的研究進(jìn)展[J];中國農(nóng)學(xué)通報(bào);2012年18期

3 朱俊子;周倩;崔亞;高必達(dá);;南方水稻黑條矮縮病毒的新的自然寄主[J];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2012年01期

4 曹楊;潘峰;周倩;李冠華;劉雙清;黃志農(nóng);李有志;;南方水稻黑條矮縮病毒介體昆蟲白背飛虱的傳毒特性[J];應(yīng)用昆蟲學(xué)報(bào);2011年05期

5 季英華;高瑞珍;張野;程兆榜;周彤;范永堅(jiān);周益軍;;一種快速同步檢測水稻黑條矮縮病毒和南方水稻黑條矮縮病毒的方法[J];中國水稻科學(xué);2011年01期

6 王華弟;祝增榮;陳劍平;汪恩國;李寶福;;水稻黑條矮縮病發(fā)生流行規(guī)律、監(jiān)測預(yù)警與防控關(guān)鍵技術(shù)[J];浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào);2007年03期

7 花文蘇,趙守桂,陸其通;玉米水稻種植區(qū)玉米粗縮病發(fā)生規(guī)律及防治技術(shù)[J];中國植保導(dǎo)刊;2005年05期

8 張凌娣,王朝輝,王獻(xiàn)兵,張衛(wèi)華,李大偉,韓成貴,翟亞鋒,于嘉林;兩種植物病毒編碼蛋白的基因沉默抑制子功能鑒定[J];科學(xué)通報(bào);2005年03期

9 李春波,鐘永旺,張旭東,魏春紅,李毅;水稻黑條矮縮病毒第九號(hào)基因片段的克隆和表達(dá)[J];微生物學(xué)報(bào);2003年03期

10 白逢偉,曲志才,許嘉,葉鳴明,許云敏,沈大棱;水稻黑條矮縮病毒基因組第九組分cDNA的克隆及序列分析[J];復(fù)旦學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2001年06期

本文編號(hào)：2694600