【摘要】：紅球菌R04(Rhodococcus sp.R04)是一株可以有效降解聯(lián)苯/多氯聯(lián)苯的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌,課題組前期已經(jīng)對(duì)其降解聯(lián)苯/多氯聯(lián)苯的功能做了大量研究,在研究中發(fā)現(xiàn),紅球菌R04代謝聯(lián)苯的過(guò)程中聯(lián)苯也反作用于R04細(xì)胞,使細(xì)胞分裂受阻,無(wú)法形成正常的分裂隔膜,且代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一系列的代謝產(chǎn)物,如2,3-二羥基聯(lián)苯(DHBP)、2-羥基-6-酮基-6-苯基-2,4-己二烯酸(HOPDA)等,究竟是哪種代謝產(chǎn)物或者聯(lián)苯自身對(duì)紅球菌R04細(xì)胞分裂產(chǎn)生的強(qiáng)大抑制作用還不清楚;同時(shí)在細(xì)胞分裂過(guò)程中,FtsZ作為重要的分裂蛋白對(duì)細(xì)胞有重要的意義,聯(lián)苯脅迫下紅球菌R04細(xì)胞出現(xiàn)的分裂異常是否與FtsZ蛋白有直接關(guān)系這是本研究要重點(diǎn)解決的問(wèn)題。在本研究中,成功將紅球菌R04的FtsZ蛋白在大腸桿菌BL21中進(jìn)行異源表達(dá),表達(dá)量高且為可溶性蛋白,通過(guò)鈷柱或鎳柱親和層析,得到純度較高的FtsZ蛋白并制備多克隆抗體。多克隆抗體的成功制備,為進(jìn)一步深入研究FtsZ蛋白在紅球菌R04中的定位以及表達(dá)情況提供有力材料,可以通過(guò)Western blot檢測(cè)在聯(lián)苯培養(yǎng)下紅球菌R04細(xì)胞內(nèi)不同時(shí)期FtsZ蛋白的表達(dá)情況,也可以利用免疫熒光技術(shù)觀察聯(lián)苯及其代謝物培養(yǎng)下細(xì)胞處于對(duì)數(shù)期時(shí)FtsZ蛋白在胞內(nèi)的定位情況,為進(jìn)一步研究FtsZ蛋白與紅球菌R04細(xì)胞分裂和隔膜形成之間的相互作用關(guān)系提供理論基礎(chǔ)。為了進(jìn)一步研究紅球菌R04 FtsZ蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)定位以及對(duì)大腸桿菌形態(tài)的影響,我們構(gòu)建了融合表達(dá)質(zhì)粒pET-m3c-ftsZ-rfp,通過(guò)IPTG誘導(dǎo)含有融合表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌發(fā)現(xiàn),隨著IPTG濃度的升高,大腸桿菌絲狀化明顯,細(xì)胞分裂受到阻滯,通過(guò)對(duì)FtsZ蛋白進(jìn)行熒光標(biāo)記發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分裂過(guò)程中FtsZ定位于Z環(huán)處,可以說(shuō)明FtsZ蛋白作為細(xì)胞分裂相關(guān)蛋白參與了隔膜環(huán)的形成,影響細(xì)胞的形態(tài)和分裂。其次我們還用聯(lián)苯及其代謝物培養(yǎng)了含有融合表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌,研究發(fā)現(xiàn)DHBP培養(yǎng)條件下,大腸桿菌細(xì)胞體積明顯縮小,生長(zhǎng)停滯,FtsZ蛋白幾乎不表達(dá),所以我們推測(cè)聯(lián)苯代謝物2,3-二羥基聯(lián)苯(DHBP)對(duì)大腸桿菌的分裂以及FtsZ蛋白的表達(dá)產(chǎn)生強(qiáng)烈的抑制作用。為了研究是聯(lián)苯自身還是其代謝物對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的抑制作用,我們分別用聯(lián)苯培養(yǎng)代謝酶缺陷型紅球菌R04及幾種模式菌株,發(fā)現(xiàn)與前體-聯(lián)苯及代謝產(chǎn)物HOPDA相比,DHBP對(duì)所有研究對(duì)象,不論是G~+或是G~-細(xì)菌,或是酵母細(xì)胞分裂都有較強(qiáng)的抑制和形態(tài)的改變。DHBP可使代謝酶缺陷型紅球菌R04分裂時(shí)形成不完整的隔膜,分裂一側(cè)或端部出現(xiàn)腫脹的小結(jié),影響其正常分裂;DHBP導(dǎo)致大腸桿菌BL21生長(zhǎng)緩慢,細(xì)胞體積縮小,細(xì)胞表面發(fā)生凹陷,胞質(zhì)內(nèi)容物流失;DHBP抑制枯草芽孢桿菌WB600分裂,細(xì)胞體積明顯縮小,而聯(lián)苯存在時(shí),枯草芽孢桿菌隔膜異常,菌體比對(duì)照長(zhǎng)約2~3倍;用DHBP處理過(guò)的金黃色葡萄球菌、紅酵母,其分裂受到影響,具有分裂隔膜的金黃色葡萄球菌細(xì)胞明顯變少,出芽生殖的紅酵母細(xì)胞比例也從64.2%下降到19.3%。
【圖文】：

第一章 文獻(xiàn)綜述第一章 文獻(xiàn)綜述系列蛋白質(zhì)共同協(xié)調(diào)細(xì)胞的分裂，并且為隔膜環(huán)的多蛋白復(fù)合物[1-3]。該過(guò)程始，Z 環(huán)是分裂裝置的核心，它作為著陸還可以使用來(lái)自 GTP 水解的能量來(lái)驅(qū)動(dòng)及在細(xì)胞中的位置。構(gòu)成隔膜環(huán)的其他蛋的 FtsZ、FtsA、ZipA、ZapA；（2）連接 與染色體分離 FtsK；（4）合成肽聚糖細(xì)胞 AmiC、EnvC。隔膜環(huán)還含有許多功FtsB 和 FtsN[4]。其中 ftsZ 可能是基因中動(dòng)子負(fù)責(zé)高水平 ftsZ 基因的表達(dá)。

圖 1.2 大腸桿菌和枯草芽孢桿菌細(xì)胞分裂模型igure 1.2 The cell division pattern of the E.coli and B苯苯的危害物是一類較為常見(jiàn)的環(huán)境化合物，其中化性質(zhì)極為穩(wěn)定，，并且在一些工業(yè)生產(chǎn)中被物累積效應(yīng)及其潛在的致癌性，主要存在于長(zhǎng)期穩(wěn)定的存在于環(huán)境中，對(duì)人類健康及生胞產(chǎn)生較大的毒害作用，有研究表明 PCB時(shí)對(duì)腸道微生物也產(chǎn)生副作用[12]。當(dāng)有機(jī)這些化合物對(duì)有機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育會(huì)造成一定會(huì)改變伯克氏菌的比表面積，導(dǎo)致細(xì)胞壁和多氯聯(lián)苯能夠抑制包括沙雷氏菌屬，假單
【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q935

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本文編號(hào)：2694327