【摘要】：土壤鹽漬化是一個(gè)世界性的農(nóng)業(yè)問(wèn)題,嚴(yán)重影響了作物的生產(chǎn)性能。棉花是我國(guó)主要的經(jīng)濟(jì)作物之一,相較于其他農(nóng)作物如玉米、小麥、水稻等具有更高的耐鹽性。盡管如此,棉花的生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量還是受到了鹽脅迫的嚴(yán)重影響。因此,挖掘棉花耐鹽基因,培育耐鹽棉花新品種,對(duì)于鹽堿地的充分開(kāi)發(fā)利用具有重要意義。植物中的鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)體在調(diào)控植株中的鈉離子積累水平,響應(yīng)鹽脅迫中發(fā)揮重要作用。陸地棉GhBASS5基因是Bile acid:Na(膽汁酸/鈉)共轉(zhuǎn)運(yùn)家族基因,編碼鈉依賴性的酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)體。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)GhBASS5在響應(yīng)棉花鹽脅迫時(shí)下調(diào)應(yīng)答,沉默GhBASS5能降低棉花中的Na~+含量,提高棉花的耐鹽性。因此,GhBASS5是否具有促進(jìn)Na~+向地上部運(yùn)輸?shù)墓δ苁潜狙芯康闹攸c(diǎn)。本研究中使用RT-PCR和qRT-PCR檢測(cè)GhBASS5的表達(dá)水平,結(jié)果表明GhBASS5在根中表達(dá)量最高且其轉(zhuǎn)錄受NaCl誘導(dǎo)下調(diào)表達(dá)。GhBASS5-GFP的在棉花子葉中的瞬時(shí)表達(dá)同樣證明其定位于葉綠體膜。此外,為進(jìn)一步研究GhBASS5的耐鹽功能。本研究構(gòu)建了超表達(dá)GhBASS5擬南芥材料。使用潮霉素篩選轉(zhuǎn)基因株系,對(duì)轉(zhuǎn)GhBASS5基因植株進(jìn)行PCR檢測(cè)并利用半定量PCR檢測(cè)GhBASS5基因的表達(dá)水平,篩選出GhBASS5超表達(dá)水平較高的兩個(gè)株系。以轉(zhuǎn)GhBASS5基因擬南芥的T4代純合植株為實(shí)驗(yàn)材料,以野生型擬南芥(WT)作為對(duì)照,從鹽脅迫下的種子萌發(fā)、苗期生理生化指標(biāo)測(cè)定和鈉鉀離子積累水平考察擬南芥的耐鹽性的差異。得到結(jié)果如下:1.分別在未添加NaCl和添加NaCl的培養(yǎng)基上點(diǎn)種擬南芥種子,研究發(fā)現(xiàn),在正常生長(zhǎng)條件下,轉(zhuǎn)GhBASS5株系與野生型擬南芥的發(fā)芽率沒(méi)有顯著差異,而在鹽脅迫條件下,轉(zhuǎn)基因株系的發(fā)芽率明顯低于野生型。2.正常生長(zhǎng)條件下,GhBASS5超表達(dá)擬南芥與野生型擬南芥相比,其脯氨酸、可溶性糖、MDA、O_2~-含量和SOD酶活性沒(méi)有顯著差異,但H_2O_2含量顯著高于野生型。鹽脅迫條件下,轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片中脯氨酸和可溶性糖含量顯著低于野生型,但MDA、O_2~-、H_2O_2含量顯著高于野生型。另外,其SOD酶活性也低于野生型,這些結(jié)果表明,野生型擬南芥比轉(zhuǎn)基因擬南芥具有更高的耐鹽性。3,正常生長(zhǎng)條件下,轉(zhuǎn)基因擬南芥地上部積累的鈉離子已經(jīng)顯著高于野生型擬南芥。鹽脅迫后,轉(zhuǎn)基因和野生擬南芥地上部Na~+均顯著升高,但轉(zhuǎn)基因植株葉片中積累的鈉離子含量顯著高于野生型。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),超表達(dá)GhBASS5顯著增加了木質(zhì)部莖流中鈉離子的含量。以上結(jié)果表明,超表達(dá)GhBASS5基因擬南芥的耐鹽性低于野生型擬南芥,過(guò)表達(dá)GhBASS5通過(guò)促進(jìn)Na~+向地上部的運(yùn)輸,增加地上部的Na~+含量,破壞質(zhì)體功能,進(jìn)而破壞植物的抗氧化系統(tǒng)等機(jī)制增加了轉(zhuǎn)基因擬南芥的敏鹽性。
【圖文】：

M NaCl 處理2 d后GhBASS5基因在棉花葉片，莖和根A：半定量PCR結(jié)果；B：熒光定量PCR結(jié)果。 的亞細(xì)胞定位pCAMBIA1300-GhBASS5-eGFP載體，并從中-GFP片段，通過(guò)LIC的連接方法將其連接到γ2MV載體注射煙草葉片，生產(chǎn)BSMV病毒，在實(shí)現(xiàn)了GhBASS-GFP融合蛋白的表達(dá)。使用胞，結(jié)果表明，GhBASS5定位于葉綠體膜（果一致。

2.3.2 GhBASS5 的亞細(xì)胞定位我們構(gòu)建了pCAMBIA1300-GhBASS5-eGFP載體，并從中擴(kuò)增出了帶有LIC序列的GhBASS5-GFP片段，通過(guò)LIC的連接方法將其連接到γ2載體中（圖2.2），使用四系統(tǒng)的BSMV載體注射煙草葉片，生產(chǎn)BSMV病毒，在棉花種子萌發(fā)期接種，在棉花幼苗中實(shí)現(xiàn)了GhBASS-GFP融合蛋白的表達(dá)。使用熒光顯微鏡觀察棉花子葉下表皮細(xì)胞，結(jié)果表明，GhBASS5定位于葉綠體膜（圖2.3），與擬南芥AtBASS5的定位結(jié)果一致。圖2.2 γ2-GhBASS5-GFP載體的構(gòu)建A：pCAMBIA1300-GhBASS5-eGFP載體的驗(yàn)證，以構(gòu)建的pCAMBIA1300-GhBASS5-eGFP載體質(zhì)粒為模板
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q943.2

【相似文獻(xiàn)】

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1 劉智賢;轉(zhuǎn)GhBASS5基因擬南芥的敏鹽機(jī)理研究[D];鄭州大學(xué);2019年

2 史迎惠;陸地棉GhBASS5基因克隆與功能分析[D];鄭州大學(xué);2018年

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本文編號(hào)：2666286