【摘要】：土壤鹽漬化是一個世界性的農業(yè)問題,嚴重影響了作物的生產性能。棉花是我國主要的經濟作物之一,相較于其他農作物如玉米、小麥、水稻等具有更高的耐鹽性。盡管如此,棉花的生長發(fā)育和產量還是受到了鹽脅迫的嚴重影響。因此,挖掘棉花耐鹽基因,培育耐鹽棉花新品種,對于鹽堿地的充分開發(fā)利用具有重要意義。植物中的鈉離子轉運體在調控植株中的鈉離子積累水平,響應鹽脅迫中發(fā)揮重要作用。陸地棉GhBASS5基因是Bile acid:Na(膽汁酸/鈉)共轉運家族基因,編碼鈉依賴性的酮酸轉運體。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)GhBASS5在響應棉花鹽脅迫時下調應答,沉默GhBASS5能降低棉花中的Na~+含量,提高棉花的耐鹽性。因此,GhBASS5是否具有促進Na~+向地上部運輸的功能是本研究的重點。本研究中使用RT-PCR和qRT-PCR檢測GhBASS5的表達水平,結果表明GhBASS5在根中表達量最高且其轉錄受NaCl誘導下調表達。GhBASS5-GFP的在棉花子葉中的瞬時表達同樣證明其定位于葉綠體膜。此外,為進一步研究GhBASS5的耐鹽功能。本研究構建了超表達GhBASS5擬南芥材料。使用潮霉素篩選轉基因株系,對轉GhBASS5基因植株進行PCR檢測并利用半定量PCR檢測GhBASS5基因的表達水平,篩選出GhBASS5超表達水平較高的兩個株系。以轉GhBASS5基因擬南芥的T4代純合植株為實驗材料,以野生型擬南芥(WT)作為對照,從鹽脅迫下的種子萌發(fā)、苗期生理生化指標測定和鈉鉀離子積累水平考察擬南芥的耐鹽性的差異。得到結果如下:1.分別在未添加NaCl和添加NaCl的培養(yǎng)基上點種擬南芥種子,研究發(fā)現(xiàn),在正常生長條件下,轉GhBASS5株系與野生型擬南芥的發(fā)芽率沒有顯著差異,而在鹽脅迫條件下,轉基因株系的發(fā)芽率明顯低于野生型。2.正常生長條件下,GhBASS5超表達擬南芥與野生型擬南芥相比,其脯氨酸、可溶性糖、MDA、O_2~-含量和SOD酶活性沒有顯著差異,但H_2O_2含量顯著高于野生型。鹽脅迫條件下,轉基因擬南芥葉片中脯氨酸和可溶性糖含量顯著低于野生型,但MDA、O_2~-、H_2O_2含量顯著高于野生型。另外,其SOD酶活性也低于野生型,這些結果表明,野生型擬南芥比轉基因擬南芥具有更高的耐鹽性。3,正常生長條件下,轉基因擬南芥地上部積累的鈉離子已經顯著高于野生型擬南芥。鹽脅迫后,轉基因和野生擬南芥地上部Na~+均顯著升高,但轉基因植株葉片中積累的鈉離子含量顯著高于野生型。進一步研究發(fā)現(xiàn),超表達GhBASS5顯著增加了木質部莖流中鈉離子的含量。以上結果表明,超表達GhBASS5基因擬南芥的耐鹽性低于野生型擬南芥,過表達GhBASS5通過促進Na~+向地上部的運輸,增加地上部的Na~+含量,破壞質體功能,進而破壞植物的抗氧化系統(tǒng)等機制增加了轉基因擬南芥的敏鹽性。
【圖文】：

M NaCl 處理2 d后GhBASS5基因在棉花葉片，莖和根A：半定量PCR結果；B：熒光定量PCR結果。 的亞細胞定位pCAMBIA1300-GhBASS5-eGFP載體，并從中-GFP片段，通過LIC的連接方法將其連接到γ2MV載體注射煙草葉片，生產BSMV病毒，在實現(xiàn)了GhBASS-GFP融合蛋白的表達。使用胞，結果表明，GhBASS5定位于葉綠體膜（果一致。

2.3.2 GhBASS5 的亞細胞定位我們構建了pCAMBIA1300-GhBASS5-eGFP載體，并從中擴增出了帶有LIC序列的GhBASS5-GFP片段，通過LIC的連接方法將其連接到γ2載體中（圖2.2），使用四系統(tǒng)的BSMV載體注射煙草葉片，生產BSMV病毒，在棉花種子萌發(fā)期接種，在棉花幼苗中實現(xiàn)了GhBASS-GFP融合蛋白的表達。使用熒光顯微鏡觀察棉花子葉下表皮細胞，結果表明，GhBASS5定位于葉綠體膜（圖2.3），與擬南芥AtBASS5的定位結果一致。圖2.2 γ2-GhBASS5-GFP載體的構建A：pCAMBIA1300-GhBASS5-eGFP載體的驗證，以構建的pCAMBIA1300-GhBASS5-eGFP載體質粒為模板
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q943.2

【相似文獻】

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1 劉智賢;轉GhBASS5基因擬南芥的敏鹽機理研究[D];鄭州大學;2019年

2 史迎惠;陸地棉GhBASS5基因克隆與功能分析[D];鄭州大學;2018年

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本文編號：2666286