【摘要】：干擾素γ(interferon-γ,IFN-γ)在先天免疫、炎癥反應(yīng)、適應(yīng)性免疫、腫瘤免疫等生命過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。IFN-γ結(jié)合膜表面受體IFN-γR并激活其下游的JAK1、JAK2,進(jìn)一步磷酸化轉(zhuǎn)錄因子STAT1,STAT1進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)結(jié)合靶基因.的特征性GAS(Gamma interferon activation site)元件,啟動干擾素刺激基因(interferon stimulated gene,ISG)的表達(dá)。ISG中包含有趨化因子、抗原呈遞分子、吞噬受體和各種具.有抗.菌抗病毒效應(yīng)的細(xì)胞因子,參與細(xì)胞內(nèi)病原體的防御,炎癥與免疫反應(yīng)調(diào)節(jié),腫瘤免疫等免疫過程。IFN-γR由兩種亞基組成:IFNγR1和IFNγR2。IFNγR1表達(dá)相對過剩,IFN-γ信號通路反應(yīng)性水平由IFNγR2的表達(dá)量決定。因此闡明IFNγR2的調(diào)控機制有助于深入理解與IFN-γ信號通路有關(guān)的免疫反應(yīng)和疾病發(fā)生過程,具有潛在的臨床意義。目前關(guān)于IFNγR2的研究主要涉及其定位及功能,其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制研究少見報道。本研究擬通過構(gòu)建IFNγR2熒光報告系統(tǒng),為發(fā)現(xiàn)可調(diào)控IFNγR2轉(zhuǎn)錄水平的基因、小分子藥物,進(jìn)一步探索其調(diào)控方式和及其分子機制等提供有力工具。我們將小鼠Ifngr2基因的啟動子序列放置于綠色熒光蛋白開放閱讀框架上游,并將其共同插入慢病毒載體中,進(jìn)一步通過慢病毒感染系統(tǒng)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)Ifngr2啟動子調(diào)控EGFP表達(dá)的Myc-Cap細(xì)胞系,以此細(xì)胞系用作研究IFNγR2調(diào)控的熒光報告體系。我們發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)和奧沙利鉑:(oxaliplatin):可以明顯:上調(diào)Ifngr2基因的轉(zhuǎn)錄水平。TNF-α是機體系統(tǒng)性炎癥急性期的重要細(xì)胞因子,主要由激活的巨噬細(xì)胞分泌,調(diào)控各種免疫過程并可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。TNF-α結(jié)合細(xì)胞表面的TNFR,激活下游NF-κB信號通路和MAPK信號通路。我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)NF-κB的亞基p65可上調(diào)Ifngr2。分別用IKK-β抑制劑IKK2 inhibitor IV、ML120B和蛋白酶體抑制劑MG132抑制NF-κB信號通路時候的激活,TNF-α均不能上調(diào)Ifngr2。這表明TNF-α通過NF-κB信號通路調(diào)控Ifngr2,這種調(diào)控發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。MAPK信號通路抑制劑U1026、SP100625不能阻斷TNF-α促進(jìn)Ifngr2上調(diào),提示MAPK信號通路可能不參與TNF-α上調(diào)Ifngr2的過程。為進(jìn)一步明確Ifngr2啟動子中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄元件,我們構(gòu)建小鼠Ifngr2基因啟動子熒光素酶報告系統(tǒng),通過系列截短分析探索Ifngr2基因啟動子中轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵區(qū)域。生物信息學(xué)工具分析發(fā)現(xiàn)Ifngr2基因啟動子-111--102片段GGGAAAGTCC為NF-κB結(jié)合位點,并通過突變分析對其進(jìn)行了確認(rèn)。Oxaliplatin作為一種抗腫瘤藥物,廣泛應(yīng)用于多種腫瘤的化療方案中。在細(xì)胞水平我們發(fā)現(xiàn)oxaliplatin.上調(diào)IFNγR2。我們建立了Myc-Cap皮下移植瘤動物模型型在動物水平初步探索了oxaliplatin對IFNγR2的調(diào)控作用和抗腫瘤免疫效應(yīng)。本研究中我們構(gòu)建了IFNγR2熒光報告體系,發(fā)現(xiàn)了TNF-α和oxaliplatin明顯上調(diào)IFNGR2轉(zhuǎn)錄水平,并明確了TNF-α通過NF-κB信號通路調(diào)控IFNγR2。通過構(gòu)建熒光素酶報告系統(tǒng),發(fā)現(xiàn)并驗證了Ifngr2啟動子中NF-κB結(jié)合位點。我們還對oxaliplatin對IFNγR2和抗腫瘤免疫的調(diào)控作用進(jìn)行了初步探索。以上研究共同為闡明Ifngr2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制打下堅實的基礎(chǔ)。
【圖文】：

第 38 頁圖 1 IFN R2 熒光報告體系的構(gòu)建A. IFN R2 熒光報告體系的示意圖 B. 從 MEF 基因組擴增 Ifngr2 基因啟動子-1344~+48 區(qū)域，泳道 1 為 PCR 產(chǎn)物，M 為 DNA marker C. 穩(wěn)定表達(dá)Ifngr2-promoter-EGFP 細(xì)胞系 Myc-Ifngr2 基因組 EGFP 特異性引物 PCR 結(jié)果，空細(xì)胞為陰性對照 D.流式分析 Myc-Ifngr2 的平均熒光值2 TNF- 和 Oxaliplatin 上調(diào) IFN R2應(yīng)用 IFN R2 熒光報告體系，我們發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子（tumor necrosis factoralpha，，TNF- ）和化療藥物奧沙利鉑（oxaliplatin）均能提高報告體系平均熒光值（mean fluorescent intensity，MFI）。如圖 2A、2B 所示 20 ng/mL TNF- 處理細(xì)胞48h，2 nM oxaliplatin 處理細(xì)胞 48h，報告系統(tǒng) MFI 均顯著提高。這提示 TNF- 和

圖 2 TNF- 和 oxaliplatin 上調(diào) IFN R2 的表達(dá)A. TNF- 上調(diào) Myc-Ifngr2 報告體系 MFI B. Oxaliplatin 上調(diào) Myc-Ifngr2 報告體系 MFI第二部分 TNF-α 通過激活 NF- B 通路上調(diào) Ifngr21 TNF- 上調(diào) Ifngr2TNF- 是一類細(xì)胞因子，在免疫和炎癥等生命活動中發(fā)揮關(guān)鍵作用。TNF-可以通過細(xì)胞膜表面的 TNF 受體激活三條信號通路，分別是 NF-κB 信號通路、MAPK 信號通路和 caspase8 依賴的凋亡信號通路。TNF- 可以刺激細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，如 IL-6、IFN- 、IFN-β 等，但其對 IFN- 信號通路影響的并不明確。為了驗證 TNF- 對于 IFNGR2 的調(diào)控作用，我們通過 qPCR 技術(shù)檢測了 TNF- 對Ifngr2 的表達(dá)水平的影響。20ng/mL TNF- 刺激 Myc-Cap 細(xì)胞系 1h、3h，Ifngr2
【學(xué)位授予單位】：軍事科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q75

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3 孫e鹐

本文編號：2658378