【摘要】：植物從種子萌發(fā)到幼苗光形態(tài)建成過程,葉綠體發(fā)育對于幼苗從異養(yǎng)到光合自養(yǎng)順利轉(zhuǎn)變至關(guān)重要。從初始的原質(zhì)體到發(fā)育有成熟的類囊體結(jié)構(gòu)的葉綠體,其中伴隨著光合作用相關(guān)基因合成,葉綠素合成,核質(zhì)信號交流調(diào)節(jié)葉綠體發(fā)育等過程。葉綠體負(fù)責(zé)植物的CO_2固定、碳骨架制造、脂肪酸、色素和氨基酸合成等。糖在植物的生長發(fā)育過程中,不僅是能量來源和結(jié)構(gòu)物質(zhì),同時也是植物發(fā)育調(diào)控的重要信號分子。近年研究證實了糖作為信號分子影響核基因表達(dá),特別是抑制核編碼的光合作用基因表達(dá),如葉綠素結(jié)合蛋白基因、二磷酸核酮糖羧化酶小亞基基因等。目前,通過多種篩選手段,雖已從植物中分離破壞不同階段葉綠體發(fā)育的多種突變體,并研究相應(yīng)突變基因在葉綠體發(fā)育調(diào)節(jié)作用,但葉綠體發(fā)育的調(diào)控機制研究還不完善,需要選擇合適角度探究發(fā)掘新的突變體。糖作為調(diào)節(jié)葉綠體發(fā)育的關(guān)鍵因素,將糖作為篩選條件,尋找葉綠體發(fā)育異常突變體,并研究突變基因在葉綠體發(fā)育中的作用,將為深入理解葉綠體發(fā)育的機制提供新線索。本研究用缺蔗糖培養(yǎng)基培養(yǎng)EMS(甲基磺酸乙酯)誘變的擬南芥M2突變?nèi)后w,篩選葉綠體發(fā)育異常突變體。獲得一株幼苗子葉白化突變體,命名為sca1(seedling cotyledon albino 1)。表型分析發(fā)現(xiàn),突變體sca1幼苗在無糖培養(yǎng)基上子葉呈白化狀態(tài),且外源施加各種糖不能恢復(fù)其子葉白化表型。與野生型相比,突變體sca1表現(xiàn)葉綠體小且基粒垛疊層少,葉綠素?zé)晒鈪?shù)F0、Fm和NPQ降低,光合色素含量降低等。隨著生長期的延長,突變體sca1的真葉白化有所復(fù)綠,但表現(xiàn)生長緩慢,分枝數(shù)多,花畸形,結(jié)實率低,生長周期長。有文獻(xiàn)報道高光下缺乏類胡蘿卜素保護(hù)的光氧化損傷會導(dǎo)致葉綠素?fù)p傷,造成葉片白化。用強弱光處理突變體sca1,發(fā)現(xiàn)弱光處理可以使sca1突變體出現(xiàn)子葉復(fù)綠,推測sca1子葉白化可能是類胡蘿卜素合成缺陷導(dǎo)致葉綠素光氧化損傷。遺傳分析顯示,突變體sca1表型性狀是單基因隱性突變所致。圖位克隆顯示突變基因定位于二號染色體F14M13和T19L18之間編號為D的BAC上。將該BAC上26個有效基因進(jìn)行測序分析,發(fā)現(xiàn)有三個基因出現(xiàn)有效突變并分別命名為D1、D2和D3。經(jīng)查閱文獻(xiàn),發(fā)現(xiàn)三個基因均為未知基因。為了確定目的基因,特構(gòu)建了三個基因的35S::GFP載體,并利用基因槍轉(zhuǎn)化和農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化sca1突變體,發(fā)現(xiàn)無論是瞬轉(zhuǎn)材料還是篩選的永久材料,D1基因的轉(zhuǎn)入均能使突變體葉色恢復(fù)至綠色,推測D1基因可能是控制突變體子葉白化的基因。亞細(xì)胞定位分析,顯示D1候選基因編碼蛋白定位于細(xì)胞核,D2候選基因編碼蛋白定位于細(xì)胞質(zhì),D3候選基因編碼蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)。綜上所述,我們篩選到子葉白化突變體sca1,經(jīng)過強弱光處理,證明sca1子葉白化可能是類胡蘿卜素合成缺陷導(dǎo)致葉綠素光氧化損傷。突變體sca1圖位克隆定位到三個候選基因D1、D2和D3。通過瞬時轉(zhuǎn)化和超表達(dá)材料的篩選,證明了D1基因控制突變體子葉白化。后續(xù)將對已訂購的突變體種子進(jìn)行純合體鑒定和表型分析,確定突變基因,研究其生物學(xué)功能,有望在解釋葉綠體發(fā)育調(diào)控上有所突破。
【圖文】：

黃質(zhì)深度環(huán)氧化酶（VDE）形成葉黃素循環(huán)，是一種保護(hù)植物免受光損傷的機制（Jahnsand Holzwarth, 2012）。圖1-2 類胡蘿卜素在質(zhì)體中的代謝途徑示意圖（Sun et al., 2018）類胡蘿卜素合成始于C5 IPP和DMAPP通過MEP途徑而形成。其關(guān)鍵步驟酶是GGPS11。而番茄紅素環(huán)化反應(yīng)產(chǎn)生了該途徑的a和b分支。分別控制類胡蘿卜素的轉(zhuǎn)化和類胡蘿卜素在質(zhì)體中的穩(wěn)定貯藏。Figure 1-2 Schematic representation of the plant carotenoid metabolic pathway in plastids (Sun et al., 2018)Carotenoid biosynthesis begins with the formation of C5 IPP and DMAPP via the MEP pathway. The keyenzyme is GGPS11. Lycopene cyclization yields the a and b branch of the pathway, Control thetransformation of carotenoids and stable storage of carotenoids in plastids.葉綠體是綠色組織中的光合質(zhì)體。豐富的類胡蘿卜素存在于葉綠體類囊體膜中，用于光合作用和光保護(hù)作用（Ruban, 2016）。葉綠體中活性類胡蘿卜素的生物合成主要發(fā)生在包被膜中（Ruiz-Sola and Rodriguez-Concepcion, 2012）。沒有類胡蘿卜素,葉綠體就不能正常運作，植物也就無法生存。雖然在光合組織中敲除PSY和PDS會導(dǎo)致光合作用的完全廢除，但葉黃素生物合成基因的突變并不會導(dǎo)致致死表型，反而會對光保護(hù)產(chǎn)生負(fù)面影響（KimandDellaPenna, 2006）。光保護(hù)是植物在強光脅迫下更好地生存的機制之一。類胡蘿卜素通過抑制葉綠素激發(fā)態(tài)、清除活性氧、將多余能量轉(zhuǎn)化為熱能等作用，

擬南芥子葉白化突變體 sca1 的篩選及鑒定14圖1-3 圖位克隆技術(shù)路線示意圖（Jander et al., 2002）Figure 1-3 A moderl of gene map-based cloning(Jander et al., 2002)1.7 立題依據(jù)根據(jù)以上研究背景介紹，我們清楚地了解到植物葉片生長發(fā)育、植物葉綠體發(fā)育和光合色素合成對光合作用的影響。而葉色突變體的形成又與植物葉片結(jié)構(gòu)、葉綠體代謝、光合色素效率及光合作用有關(guān)，目前人們對能直接引起這四個過程變化的研究已經(jīng)比較透徹，，但還有很多是不直接參與這四個過程也能導(dǎo)致葉綠體發(fā)育異常的因素。正如糖不僅作為一種能源物質(zhì)，在植物中也可以充當(dāng)信號分子來調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育。而且已經(jīng)有報導(dǎo)稱糖可以抑制光合作用基因表達(dá)，也有報道稱糖對液體培養(yǎng)的整個幼苗期或蓮座葉期擬南芥葉綠體編碼基因有顯著抑制作用（Gonzaliet al., 2006; Osuna et al., 2007）。尋找新條件探究葉綠體發(fā)育異常調(diào)控因子意義重大。有研究表明，糖不僅對葉綠體編碼轉(zhuǎn)錄本和葉綠體形態(tài)有作用外，還可以誘導(dǎo)GPT2的表達(dá)（Van Dingenen et al., 2016），而缺乏GPT2表達(dá)的幼苗子葉的建立和綠化較晚(Dyson et al., 2014)。鑒于葉綠體調(diào)節(jié)因素的復(fù)雜性
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q945

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 鄧曉娟;張海清;王悅;舒志芬;王國槐;王國梁;;水稻葉色突變基因研究進(jìn)展[J];雜交水稻;2012年05期

2 何冰;劉玲瓏;張文偉;萬建民;;植物葉色突變體[J];植物生理學(xué)通訊;2006年01期

3 胡希遠(yuǎn);王國棟;;脈動磁場對高粱生長發(fā)育的影響[J];陜西農(nóng)業(yè)科學(xué);1993年03期

本文編號：2658006