發(fā)布時(shí)間：2020-04-05 14:20

【摘要】：二甲基巰基丙酸內(nèi)鹽(dimethylsulfo niopropionate,DMSP)是海洋中一種重要的有機(jī)硫化合物,是地球上含量最豐富的有機(jī)硫存在形式之一。全球海洋每年可產(chǎn)生大約109噸的DMSP。DMSP可以被微生物胞內(nèi)的DMSP裂解酶裂解,生成二甲基硫(dimethylsulfide,DMS)和丙烯酸。DMS是一種揮發(fā)性的氣態(tài)有機(jī)硫化合物,在全球硫循環(huán)中發(fā)揮著重要作用。它可以通過海氣交換進(jìn)入大氣,是硫元素從海洋進(jìn)入大氣中的主要形式。此外,DMS還在云凝結(jié)核的形成中發(fā)揮著作用,能夠影響云的形成。DMS在全球硫循環(huán)以及生態(tài)中有重要作用,因此其合成以及代謝方式受到了廣泛的關(guān)注。DMSP在微生物體內(nèi)被裂解時(shí)除了產(chǎn)生DMS,還會產(chǎn)生等摩爾量的丙烯酸。丙烯酸可以作為一種碳源被利用。丙烯酸的代謝產(chǎn)物為丙烯酰輔酶A,它對細(xì)胞是有毒性的,在胞內(nèi)大量積累會對生物體生理生化狀態(tài)產(chǎn)生嚴(yán)重影響,因此丙烯酰輔酶A的代謝過程也受到了廣泛關(guān)注。在本論文中,我們利用生化分析以及X射線晶體學(xué)等手段,將DMSP的下游代謝產(chǎn)物丙烯酰輔酶A和DMS這兩種物質(zhì)代謝過程中的關(guān)鍵酶作為研究對象,對這些酶的結(jié)構(gòu)、功能與催化機(jī)制進(jìn)行了研究,為系統(tǒng)闡明海洋細(xì)菌代謝DMSP的過程與分子機(jī)制提供了重要依據(jù)。(1)丙烯酰輔酶A還原酶AcuI的結(jié)構(gòu)與催化機(jī)制DMSP被海洋細(xì)菌轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)胞內(nèi)后,在DMSP裂解酶作用下被裂解,生成DMS和丙烯酸,丙烯酸可作為碳源在胞內(nèi)進(jìn)一步被代謝。丙烯酸可以在丙酰輔酶A連接酶PrpE或者�；o酶A轉(zhuǎn)移酶AcuN作用下,生成丙烯酰輔酶A。丙烯酰輔酶A對細(xì)菌細(xì)胞是有劇毒的,很低濃度的丙烯酰輔酶A就可以使細(xì)菌致死。因此,丙烯酰輔酶A不能在胞內(nèi)積累,必須盡快被代謝掉。丙烯酰輔酶A可以被丙烯酰輔酶A還原酶AcuI代謝成丙酰輔酶A,或者被丙烯酰輔酶A水合酶AcuH代謝成3-羥基丙酰輔酶A,從而防止丙烯酰輔酶A的積累影響細(xì)胞的生理生化狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)對參與丙烯酸代謝的關(guān)鍵酶PrpE以及AcuN的結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制進(jìn)行了研究。在此基礎(chǔ)上,為了闡明海洋細(xì)菌代謝丙烯酰輔酶A的分子機(jī)制,本文對參與丙烯酰輔酶A代謝的兩個(gè)關(guān)鍵酶丙烯酰輔酶A還原酶AcuI和丙烯酰輔酶A水合酶AcuH的結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制進(jìn)行了研究。AcuI蛋白能將丙烯酰輔酶A還原成丙酰輔酶A,在丙烯酰輔酶A的代謝過程中發(fā)揮重要作用。我們以來自海洋玫瑰桿菌類群的模式菌株Ruegeria pomeroyi DSS-3的AcuI作為主要研究對象,對AcuI的晶體結(jié)構(gòu)以及AcuI催化丙烯酰輔酶A生成丙酰輔酶A這一過程的分子機(jī)制進(jìn)行了研究。我們對AcuI進(jìn)行了異源表達(dá)與純化,并對該蛋白進(jìn)行了結(jié)晶與結(jié)構(gòu)解析。我們分別解析了 AcuI[沒有結(jié)合任何配體的結(jié)構(gòu)(apo-AcuI)以及結(jié)合有還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)的結(jié)構(gòu)(AcuI-NADPH)。每個(gè)AcuI的單體有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域,一個(gè)是催化結(jié)構(gòu)域,另一個(gè)是羅斯曼折疊結(jié)構(gòu)域。突變體酶活檢測結(jié)果表明,Arg323突變成丙氨酸之后,酶活力有明顯的下降。將Arg323突變成大小類似并且?guī)д姾傻馁嚢彼岷?酶活力基本沒有發(fā)生變化;而突變成大小類似但不帶電的異亮氨酸后,酶活力基本全部喪失。這些結(jié)果表明Arg323可能在催化過程中參與電子傳遞并且充當(dāng)質(zhì)子供體�；诮Y(jié)構(gòu)分析以及突變驗(yàn)證,我們提出了 AcuI催化反應(yīng)的分子機(jī)制。在該反應(yīng)中,NADPH煙酰胺C4上的氫攻擊丙烯酰輔酶A的C3并轉(zhuǎn)移電子,進(jìn)而形成烯醇中間體。烯醇中間體將電子傳遞給Arg323,最終形成產(chǎn)物丙酰輔酶A。另外,我們對Acud在海洋細(xì)菌中的分布進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)含有PrpE蛋白的菌株大多數(shù)都含有AcuI,這暗示AcuI確實(shí)在丙烯酰輔酶A的代謝中發(fā)揮重要作用。本章研究對更好地了解丙烯酰輔酶A的代謝機(jī)制有重要意義。(2)丙烯酰輔酶A水合酶RdAcuH的結(jié)構(gòu)與催化機(jī)制AcuH是一個(gè)丙烯酰輔酶A水合酶,能夠催化丙烯酰輔酶A水合生成3-羥基丙酰輔酶A,在丙烯酰輔酶A的代謝過程中發(fā)揮重要作用。我們將來自菌株R.nubinhibens ISM的AcuH(RdAcuH)作為主要研究對象,對RdAcH的晶體結(jié)構(gòu)以及其催化丙烯酰輔酶A水合反應(yīng)的分子機(jī)制進(jìn)行了研究。我們對RdAcuH進(jìn)行了異源表達(dá)與純化,并對該蛋白進(jìn)行了結(jié)晶與結(jié)構(gòu)解析。RdAcuH在不對稱單位中以同源六聚體的形式存在。每個(gè)RdAcuH單體含有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域,分別是氮端結(jié)構(gòu)域與碳端結(jié)構(gòu)域。RdAcuH的活性中心位于一個(gè)單體的氮端結(jié)構(gòu)域和相鄰單體的碳端結(jié)構(gòu)域之間。我們對RdAcuH的結(jié)構(gòu)與其同源結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較,結(jié)果表明RdAcuH的整體結(jié)構(gòu)與來自Rattus norvegicus的烯酰輔酶A水合酶ECH的結(jié)構(gòu)十分類似。我們通過序列比對和結(jié)構(gòu)疊加的方式,找到了RdAcuH中兩個(gè)保守的氨基酸殘基,Glu112和Glu132,并分別構(gòu)建了 E112A和E132A突變體并對它們的酶活力進(jìn)行檢測。生化檢測實(shí)驗(yàn)顯示這兩個(gè)突變體均喪失了酶活,表明這兩個(gè)氨基酸殘基在RdAcuH的催化反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用�；趯dAcuH結(jié)構(gòu)及點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)的分析,我們提出了RdAcuH催化反應(yīng)的分子機(jī)制。RdAcuH的Glu132攻擊一個(gè)催化相關(guān)的水分子,這個(gè)水分子被激活,進(jìn)而攻擊丙烯酰輔酶A,形成一種中間態(tài)。之后,冗余的電子傳回Glu132,水分子加到烯酰輔酶A上,從而生成了 3-羥基丙酰輔酶A。本章研究對更好地了解丙烯酰輔酶A的代謝機(jī)制有重要意義。RdAcuH除了催化丙烯酰輔酶A的水合反應(yīng)外,還能催化DMSP去甲基化途徑的下游代謝產(chǎn)物3-甲硫基丙烯酰輔酶A的水合反應(yīng)。RdAcuH的同源蛋白在很多不能代謝DMSP的菌株中也有分布,這表明RdAcuH的催化機(jī)制或許能推廣到其他代謝過程中去,有更廣泛的意義。(3)DMS單加氧酶DmoA的結(jié)晶與結(jié)構(gòu)分析DMS是一種揮發(fā)性的有機(jī)硫化物,它在全球硫循環(huán)中發(fā)揮著重要作用,DMS從海面擴(kuò)散進(jìn)入空氣是硫元素從海洋進(jìn)入到大氣最主要的形式�？諝庵械腄MS經(jīng)過一系列過程,參與形成凝結(jié)核,能夠影響云的形成。目前對DMS代謝的研究表明,生物降解是DMS最主要的降解方式。DmoA是一個(gè)DMS單加氧酶,能催化DMS代謝為甲硫醇的過程。我們把來自菌株Hyphom icrobium sulfonivorans 的DMS單加氧酶DmoA作為研究對象,對其進(jìn)行了結(jié)晶并對其晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。我們對DmoA進(jìn)行異源表達(dá)與純化,并進(jìn)行了 DmoA的結(jié)晶。在我們解析出的結(jié)構(gòu)中,每個(gè)不對稱單元中含有兩個(gè)DmoA單體。DmoA結(jié)構(gòu)由TIM桶(TIM-barrel)結(jié)構(gòu)以及額外插入?yún)^(qū)域(additio nal ins ertion,AI)構(gòu)成。DmoA的結(jié)構(gòu)中有5個(gè)額外插入?yún)^(qū)域,分別是AI1、AI2、AI3、AI4以及AI5,它們均位于外側(cè)的a螺旋和內(nèi)側(cè)的β折疊之間。這種額外插入?yún)^(qū)域在DmoA的同源結(jié)構(gòu),如長鏈烷烴單加氧酶LadA以及二苯并噻吩砜單加氧酶BdsA中也有發(fā)現(xiàn)。我們對DmoA、LadA以及BdsA三者的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了疊加比較,發(fā)現(xiàn)它們的單體結(jié)構(gòu)很相似。我們對這三個(gè)結(jié)構(gòu)的底物結(jié)合口袋進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn),DmoA的底物結(jié)合口袋與LadA及BdsA的相比要更小。DmoA結(jié)構(gòu)中較小的底物結(jié)合口袋與它較小的底物(DMS)是相一致的。底物結(jié)合口袋大小的變化主要是由這三個(gè)結(jié)構(gòu)中AI5cα3以及AI3的不同所導(dǎo)致的。本章研究對DmoA晶體結(jié)構(gòu)以及底物結(jié)合口袋進(jìn)行了分析,為更好地了解DMS的微生物降解過程提供了重要信息。(4)甲硫醇甲基轉(zhuǎn)移酶MddA的異源表達(dá)與酶學(xué)性質(zhì)研究DMS是一種重要的氣態(tài)有機(jī)硫,目前主流觀點(diǎn)都認(rèn)為DMS主要是通過海洋中DMSP的裂解產(chǎn)生的。然而有研究表明,在海洋、淡水以及陸地環(huán)境中,還存在著不依靠DMSP生成DMS的方式。在分離自南極海底沉積物的菌株P(guān)seudomonas deceptionensis M1T中發(fā)現(xiàn)了利用甲硫醇生成DMS的途徑,被稱為甲硫醇依賴的DMS生成途徑。MddA是該途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶,能以甲硫醇為底物生成DMS。MddA是一個(gè)膜蛋白,其表達(dá)純化以及生化性質(zhì)還沒有相關(guān)報(bào)道。我們對來自 P.deceptionensis M1T的甲基轉(zhuǎn)移酶MddA進(jìn)行了異源表達(dá)純化和基本酶學(xué)性質(zhì)分析。我們通過對表達(dá)載體以及表達(dá)菌株的篩選,確定了最優(yōu)的MddA大腸桿菌表達(dá)體系,即采用pET-15b為表達(dá)載體以及Escherichia coli C43(DE3)為表達(dá)菌株。我們對去污劑進(jìn)行了篩選,確定十二烷基-β-D-麥芽糖苷(n-Dodecyl-β-D-maltopyrano side,DDM)為最合適的去污劑。經(jīng)過條件優(yōu)化之后,最終純化出純度較高、性質(zhì)穩(wěn)定的MddA蛋白,從而建立了MddA 的表達(dá)純化體系。隨后我們分析了MddA 的酶學(xué)性質(zhì)。在DDM作去污劑的條件下,ddA催化反應(yīng)的最適pH為8.0,最適溫度為40℃。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究MddA晶體結(jié)構(gòu)及其催化機(jī)制奠定了重要的前期基礎(chǔ)。論文從DMSP下游代謝產(chǎn)物的代謝過程出發(fā),對在丙烯酰輔酶A代謝過程中關(guān)鍵酶AcuI和和dAcuH的結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制、DMS代謝過程中關(guān)鍵酶DmoA的結(jié)構(gòu)以及DMS合成過程中關(guān)鍵酶MddA的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。研究結(jié)果對DMSP的下游代謝過程進(jìn)行了補(bǔ)充和完善,為更好地了解DMSP的代謝過程提了重要信息。
【圖文】：

Ｄｕｙｌ邋ｅｔ邋ａｌ．邋１９９８）。ＤＭＳＰ于１９４８年在多管藻屬Ｐｏ如如ｏ？／ａ／ａ勸扣／／ａ中被鑒定逡逑出來（Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｒ邋ａｎｄ邋Ｓｉｍｐｓｏｎ邋１９４８）。ＤＭＳＰ是一種兩性離子，同時(shí)含有一個(gè)正逡逑電荷和一個(gè)負(fù)電荷（

陽車Ｓ射強(qiáng)度之間有很強(qiáng)的相關(guān)性（Ｖａｌｌｉｎａ邋ａｎｄ邋Ｓｉｍｏ邋２００７），能從側(cè)面支持這一假逡逑說。然而ＣＬＡＷ假說缺少直接證據(jù)，有學(xué)者對其提出質(zhì)疑，認(rèn)為云凝結(jié)核的來逡逑源很復(fù)雜，并非僅有ＤＭＳ—種（圖１－３）；同時(shí)ＤＭＳ濃度要最終影響到陽光反逡逑射率和海水溫度，需要云凝結(jié)核濃度發(fā)生巨大的變化，這種看似合理的假說實(shí)際逡逑上很難真正發(fā)生（Ｑｕｉｎｎ邋ａｎｄ邋Ｂａｔｅｓ邋２０１１）。但無可否認(rèn)的是，ＤＭＳ在大氣中氣溶逡逑膠以及云凝結(jié)核的形成中確實(shí)發(fā)揮著一定的作用（Ｂｒｏｏｋｓ邋ａｎｄ邋Ｔｈｏｒｎｔｏｎ邋２０１８；逡逑ＤｅｃｅｓａｒｉｅｔａＬ２０１１），，ＤＭＳ確實(shí)能夠影響云的形成。而由于影響全球氣候的條件逡逑十分復(fù)雜，ＤＭＳ對全球的氣候能有多大程度上的影響，目前還有爭議。逡逑Ｌｏｎｇ－ｒａｎｇｅ邋ｔｒａｎｓｐｏｒｔ逡逑ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｆｒｅｅ邋ｔｒｏｐｏｓｐｈｅｒｅ逡逑Ｉ邐Ｃｌｏｕｄ邋ｄｒｏｐｌｅｔｓ逡逑ｈ２ｓｏ４邋—？邋ｓｏ４逡逑ｔ邐－逡逑Ｐａｒｔｉｃｌｅ邋ｇｒｏｗｔｈ：邋ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ，逡逑ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ，邋ｃｌｏｕｄ邋ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ逡逑Ｅｎｔｒａｉｎｍｅｎｔ邋ｒａｔｅ逡逑｜邐Ｃｔｏｕｄ邋ｃｏｎｄｅ門ｓａｔｉｏｎ邋ｎｕｃｌｅｉ逡逑＾邐Ｓｅａ邋ｓａｌｔ逡逑Ｏｒｇａｎｉｃｓ逡逑Ｄｉｍｅｔｈｙｌ邋ｓｕｌｐｈｉｄｅ逡逑Ｗｉｎｄ邋ｓｐｅｅｄ．邐Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ邋ａｃｔｉｖｉｔｙ．逡逑Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ邋ａｃｔｉｖｉｔｙ．邐ｂｕｂｂｌｅ邋ｂｕｒｓｔｉｎｇ邐．逡逑ｗｉｎｄ邋ｓｐｅｅｄ邐．邐ｂｕｂｂｌｅ邋ｂｕｒｓｔｉｎｇ逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q936


本文編號：2615127