【摘要】：柑橘是我國重要的水果類作物,經(jīng)濟價值高,種植面積大。由于我國柑橘主要種植在丘陵山區(qū),因此常面臨干旱脅迫,影響其產(chǎn)量和品質。為抵御逆境脅迫,植物進化出大量抗逆相關基因,其中轉錄因子尤為重要,如:NAC、ERF、CAMTA、MYB、MYC、bZIP等。ERF是植物特有的一類轉錄因子,廣泛參與生長發(fā)育和抗逆脅迫,近年來在擬南芥、水稻和番茄等模式植物上關于ERF抗逆性研究較多,但在柑橘中卻很少報道�？梢�,解析柑橘ERF成員在抗逆中的生物功能,對改良柑橘抗逆性具有重要理論意義。本試驗從資陽香橙(Citrus junoscv.“Ziyang”)中克隆獲得CitERF108基因及其啟動子(Q108)序列。利用生物信息學對CitERF108的基因結構、親緣關系、預測蛋白特性等進行了分析,同時對Q108上的順式作用元件進行了預測。采用基因表達、亞細胞定位和遺傳轉化等手段,研究了CitERF108在抵抗干旱脅迫中的生物功能和響應機制。主要結果如下:(1)從資陽香橙中克隆獲取柑橘CitERF108(ID:Ciclev10001138)全長,運用生物信息學對其預測蛋白分子量、等電點、不穩(wěn)定系數(shù)、結構域等分析,結果表明該基因含1個內含子,可編碼448個氨基酸。CitERF108屬于親水蛋白,含有ERF家族特有的AP2保守結構域,且AP2保守結構域內第14和第19位分別是丙氨酸和天冬氨酸,含有WLG、YRG、RAYD保守元件;聚類分析發(fā)現(xiàn),CitERF108與擬南芥AtERF111親緣關系較近,推測柑橘CitERF108可能參與了ABA依賴型應激反應,并能增強植株的抗旱、抗鹽性;亞細胞定位表明:CitERF108位于細胞核中。(2)基因表達分析結果表明,CitERF108在根、葉、子葉、果皮和種子中均有表達,其中在種子中表達量最高,而在莖中幾乎不表達;激素和非生物脅迫處理結果表明,在根中該基因受SA、ETH、6-BA、IAA、ABA、JA、GA_3以及非生物脅迫干旱和鹽害的誘導;在葉中受ETH、JA誘導,而在SA處理條件下是呈現(xiàn)先上升再下降又上升的趨勢,其中3h時表達量最高,6h、12h表達量急劇下降,24h時又上調;在6-BA、ABA、GA_3條件下是先上調后下調的表達模式,都是在24h時表達量下降,其中,在6-BA和ABA處理條件下都是在6h時達到峰值,GA_3處理條件下是在3h時達到最高點;在IAA處理條件下呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢,在3h時表達量下降,6h時又開始逐步上升,在鹽害處理條件下,3h、6h、12h時上調趨勢不明顯,24h時驟然上調達到最高點,在干旱處理條件下,3h時略有下降,6h時有所上升,12h達到峰值,上述結果表明,CitERF108在柑橘的生長發(fā)育和逆境響應中發(fā)揮著重要作用。(3)將CitERF108轉化煙草,獲得T0代轉基因植株。轉基因植株較野生型表現(xiàn)出更強的抗旱性。在干旱處理后,轉基因株系葉片中脯氨酸含量高于野生型,其中,野生型株系脯氨酸含量為109.5μg,而轉基因的三個株系達到117.3μg、221.5μg和112.3μg;在轉基因株系中NtSOD和NtCAT的表達量明顯高于野生型,表明CitERF108調控了抗旱相關基因的表達;臺盼藍染色結果表明,干旱處理后的轉基因植株葉片顯色較野生型淺,表明野生型株系細胞膜的完整性較轉基因差。上述結果表明,CitERF108主要通過提高轉基因植株的脯氨酸含量和抗氧化能力來抵御干旱逆境。(4)對啟動子順式作用元件預測發(fā)現(xiàn),Q108啟動子序列中含有響應水楊酸、生長素、茉莉酸、脫落酸、乙烯以及溫度和光等順式作用元件;構建攜帶GUS基因的Q108表達載體,并轉化煙草,通過GUS組織化學染色顯示,6mmol/L的ACC溶液處理24h后,葉脈部位被染成藍色,但藍色較深的部位在葉緣;1mmol/L的ABA溶液處理24h后,葉脈部位被染成藍色,且染色較為均勻;4℃冷害處理3h后,葉脈部位被染成藍色;20%PEG6000處理24h后染色部位均在煙草腺體頂端,而無處理及對照處理均未被染成藍色。
【圖文】：

圖 1-1 植物響應逆境的一般途徑（Huang et al., 2012）-1 Generic pathway for plant response to stress（Huang et al., 2的生物活性受核定位、寡聚化、轉譯后的蛋白磷酸化化作用等的影響，且不同轉錄因子的序列和結構各異等, 2008;未麗, 2008），其主要功能是調控植物體的各 bZIP、NAC、 MYB、WRKY、 AP2/ERF 轉錄因子成、次生代謝、晝夜節(jié)律、生物及非生物脅迫、抗病廣泛存在于動物、植物、微生物中，是一類較為保守006），，該家族轉錄因子中，超表達辣椒 CAbZIP1 基因化和花瓣數(shù)量減少（陳儒鋼等, 2010）；玉米 ZmbZIP應 ABA 信號（Ying et al., 2012）；NAC 家族矮牽牛及形態(tài)建成，擬南芥 CUC2 基因影響頂端分生組織 Souer et al., 1996）；MYB 家族擬南芥 AtMYB23 基因主細胞分化過程（Matsui, 2005），AtMYB11，AtMYB1

圖 1-2 柑橘和擬南芥 ERF 家族蛋白系統(tǒng)進化樹Fig1-2 Phylogenetic tree based on protein sequences of ERF members from citrus andArabidopsis.3.3 ERF 的生物功能植物激素乙烯廣泛參與植物種子萌發(fā)、細胞伸長和凋亡、果實成熟、使瓜植物雌花增加、器官的脫落及衰老等生長發(fā)育過程。ERF 轉錄因子是乙烯信導途徑最末端的信號轉導元件（Ohmetakagi et al., 1995;張改云, 2008;王中鳳004），研究表明，該家族轉錄因子主要夠通過結合啟動子上相應的順式作用元節(jié)相關目標基因表達，進而參與植物脅迫應答（圖 1-3），如：ERF 亞家族P2 結合域能夠特異性識別 GCC-box（AGCCGCC）和 CRT/DRE（C/GCCGA類順式作用元件，這兩類順式作用元件普遍存在于與抗性相關基因的啟動子：擬南芥 AtERF2、番茄 TERF2/LeERF2、JERF1、JERF3 等（莊靜等, 2016; Ht al., 2009; Zhang et al., 2010; 陳林波, 2010; Wang et al., 2004; Zhang et al., 200
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q943.2;S666

【參考文獻】

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本文編號：2614086