【摘要】：柑橘是我國重要的水果類作物,經(jīng)濟價值高,種植面積大。由于我國柑橘主要種植在丘陵山區(qū),因此常面臨干旱脅迫,影響其產(chǎn)量和品質(zhì)。為抵御逆境脅迫,植物進化出大量抗逆相關(guān)基因,其中轉(zhuǎn)錄因子尤為重要,如:NAC、ERF、CAMTA、MYB、MYC、bZIP等。ERF是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子,廣泛參與生長發(fā)育和抗逆脅迫,近年來在擬南芥、水稻和番茄等模式植物上關(guān)于ERF抗逆性研究較多,但在柑橘中卻很少報道�？梢�,解析柑橘ERF成員在抗逆中的生物功能,對改良柑橘抗逆性具有重要理論意義。本試驗從資陽香橙(Citrus junoscv.“Ziyang”)中克隆獲得CitERF108基因及其啟動子(Q108)序列。利用生物信息學(xué)對CitERF108的基因結(jié)構(gòu)、親緣關(guān)系、預(yù)測蛋白特性等進行了分析,同時對Q108上的順式作用元件進行了預(yù)測。采用基因表達、亞細胞定位和遺傳轉(zhuǎn)化等手段,研究了CitERF108在抵抗干旱脅迫中的生物功能和響應(yīng)機制。主要結(jié)果如下:(1)從資陽香橙中克隆獲取柑橘CitERF108(ID:Ciclev10001138)全長,運用生物信息學(xué)對其預(yù)測蛋白分子量、等電點、不穩(wěn)定系數(shù)、結(jié)構(gòu)域等分析,結(jié)果表明該基因含1個內(nèi)含子,可編碼448個氨基酸。CitERF108屬于親水蛋白,含有ERF家族特有的AP2保守結(jié)構(gòu)域,且AP2保守結(jié)構(gòu)域內(nèi)第14和第19位分別是丙氨酸和天冬氨酸,含有WLG、YRG、RAYD保守元件;聚類分析發(fā)現(xiàn),CitERF108與擬南芥AtERF111親緣關(guān)系較近,推測柑橘CitERF108可能參與了ABA依賴型應(yīng)激反應(yīng),并能增強植株的抗旱、抗鹽性;亞細胞定位表明:CitERF108位于細胞核中。(2)基因表達分析結(jié)果表明,CitERF108在根、葉、子葉、果皮和種子中均有表達,其中在種子中表達量最高,而在莖中幾乎不表達;激素和非生物脅迫處理結(jié)果表明,在根中該基因受SA、ETH、6-BA、IAA、ABA、JA、GA_3以及非生物脅迫干旱和鹽害的誘導(dǎo);在葉中受ETH、JA誘導(dǎo),而在SA處理條件下是呈現(xiàn)先上升再下降又上升的趨勢,其中3h時表達量最高,6h、12h表達量急劇下降,24h時又上調(diào);在6-BA、ABA、GA_3條件下是先上調(diào)后下調(diào)的表達模式,都是在24h時表達量下降,其中,在6-BA和ABA處理條件下都是在6h時達到峰值,GA_3處理條件下是在3h時達到最高點;在IAA處理條件下呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢,在3h時表達量下降,6h時又開始逐步上升,在鹽害處理條件下,3h、6h、12h時上調(diào)趨勢不明顯,24h時驟然上調(diào)達到最高點,在干旱處理條件下,3h時略有下降,6h時有所上升,12h達到峰值,上述結(jié)果表明,CitERF108在柑橘的生長發(fā)育和逆境響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。(3)將CitERF108轉(zhuǎn)化煙草,獲得T0代轉(zhuǎn)基因植株。轉(zhuǎn)基因植株較野生型表現(xiàn)出更強的抗旱性。在干旱處理后,轉(zhuǎn)基因株系葉片中脯氨酸含量高于野生型,其中,野生型株系脯氨酸含量為109.5μg,而轉(zhuǎn)基因的三個株系達到117.3μg、221.5μg和112.3μg;在轉(zhuǎn)基因株系中NtSOD和NtCAT的表達量明顯高于野生型,表明CitERF108調(diào)控了抗旱相關(guān)基因的表達;臺盼藍染色結(jié)果表明,干旱處理后的轉(zhuǎn)基因植株葉片顯色較野生型淺,表明野生型株系細胞膜的完整性較轉(zhuǎn)基因差。上述結(jié)果表明,CitERF108主要通過提高轉(zhuǎn)基因植株的脯氨酸含量和抗氧化能力來抵御干旱逆境。(4)對啟動子順式作用元件預(yù)測發(fā)現(xiàn),Q108啟動子序列中含有響應(yīng)水楊酸、生長素、茉莉酸、脫落酸、乙烯以及溫度和光等順式作用元件;構(gòu)建攜帶GUS基因的Q108表達載體,并轉(zhuǎn)化煙草,通過GUS組織化學(xué)染色顯示,6mmol/L的ACC溶液處理24h后,葉脈部位被染成藍色,但藍色較深的部位在葉緣;1mmol/L的ABA溶液處理24h后,葉脈部位被染成藍色,且染色較為均勻;4℃冷害處理3h后,葉脈部位被染成藍色;20%PEG6000處理24h后染色部位均在煙草腺體頂端,而無處理及對照處理均未被染成藍色。
【圖文】：

圖 1-1 植物響應(yīng)逆境的一般途徑（Huang et al., 2012）-1 Generic pathway for plant response to stress（Huang et al., 2的生物活性受核定位、寡聚化、轉(zhuǎn)譯后的蛋白磷酸化化作用等的影響，且不同轉(zhuǎn)錄因子的序列和結(jié)構(gòu)各異等, 2008;未麗, 2008），其主要功能是調(diào)控植物體的各 bZIP、NAC、 MYB、WRKY、 AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子成、次生代謝、晝夜節(jié)律、生物及非生物脅迫、抗病廣泛存在于動物、植物、微生物中，是一類較為保守006），，該家族轉(zhuǎn)錄因子中，超表達辣椒 CAbZIP1 基因化和花瓣數(shù)量減少（陳儒鋼等, 2010）；玉米 ZmbZIP應(yīng) ABA 信號（Ying et al., 2012）；NAC 家族矮牽牛及形態(tài)建成，擬南芥 CUC2 基因影響頂端分生組織 Souer et al., 1996）；MYB 家族擬南芥 AtMYB23 基因主細胞分化過程（Matsui, 2005），AtMYB11，AtMYB1

圖 1-2 柑橘和擬南芥 ERF 家族蛋白系統(tǒng)進化樹Fig1-2 Phylogenetic tree based on protein sequences of ERF members from citrus andArabidopsis.3.3 ERF 的生物功能植物激素乙烯廣泛參與植物種子萌發(fā)、細胞伸長和凋亡、果實成熟、使瓜植物雌花增加、器官的脫落及衰老等生長發(fā)育過程。ERF 轉(zhuǎn)錄因子是乙烯信導(dǎo)途徑最末端的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)元件（Ohmetakagi et al., 1995;張改云, 2008;王中鳳004），研究表明，該家族轉(zhuǎn)錄因子主要夠通過結(jié)合啟動子上相應(yīng)的順式作用元節(jié)相關(guān)目標基因表達，進而參與植物脅迫應(yīng)答（圖 1-3），如：ERF 亞家族P2 結(jié)合域能夠特異性識別 GCC-box（AGCCGCC）和 CRT/DRE（C/GCCGA類順式作用元件，這兩類順式作用元件普遍存在于與抗性相關(guān)基因的啟動子：擬南芥 AtERF2、番茄 TERF2/LeERF2、JERF1、JERF3 等（莊靜等, 2016; Ht al., 2009; Zhang et al., 2010; 陳林波, 2010; Wang et al., 2004; Zhang et al., 200
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q943.2;S666

【參考文獻】

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1 范中奇;鄺健飛;陸旺金;陳建業(yè);;轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控果實成熟和衰老機制研究進展[J];園藝學(xué)報;2015年09期

2 閆婷;;植物抗逆性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的研究進展[J];內(nèi)蒙古林業(yè)科技;2014年02期

3 安澤偉;謝黎黎;王其同;李雅超;程漢;胡彥師;黃華孫;;橡膠樹轉(zhuǎn)錄因子HbERF1的克隆與功能分析[J];中國農(nóng)業(yè)科學(xué);2014年08期

4 朱世平;陳嬌;馬巖巖;閆樹堂;鐘廣炎;;柑橘砧木評價及應(yīng)用研究進展[J];園藝學(xué)報;2013年09期

5 張計育;王慶菊;郭忠仁;;植物AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子研究進展[J];遺傳;2012年07期

6 陳婷婷;楊青川;康俊梅;丁旺;張鐵軍;張新全;;3個紫花苜蓿乙烯應(yīng)答因子基因的克隆與分析[J];中國農(nóng)業(yè)科學(xué);2012年04期

7 王學(xué)全;沈曉;何峗綿;任天年;吳梧桐;奚濤;;根癌農(nóng)桿菌EHA105和LBA4404凍融法轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化研究(英文)[J];藥物生物技術(shù);2011年05期

8 趙莉;鐘鳴;馬慧;李浩戈;陳麗靜;鐘聲;;農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[J];江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué);2011年03期

9 李聰;郭天麒;梁小紅;王英博;韓烈保;;植物ERFs類轉(zhuǎn)錄因子在逆境脅迫中的作用[J];生物技術(shù)通報;2011年04期

10 陳儒鋼;鞏振輝;逯明輝;李大偉;黃煒;;植物抗逆反應(yīng)中的轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)研究進展[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報;2010年01期

本文編號：2614086