5-羥甲基糠醛(HMF)和糠醛是重要的生物基平臺化合物。N-烷基糠胺是諸多生物活性化合物的結構單元,可以通過生物基呋喃還原胺化得到。目前,N-烷基糠胺主要通過化學催化制備得到。盡管化學法已取得了較大進展,但該法仍存在羰基的自還原、亞胺或烯胺中間體的穩(wěn)定性較差、目標產物胺的過度烷基化等問題。生物催化能有效克服上述問題。在眾多催化C-N鍵形成的生物催化劑中,還原胺化酶更具潛力;相比于轉氨酶和胺脫氫酶僅能催化伯胺的合成,還原胺化酶能催化生成仲胺。然而,生物催化生物基呋喃還原胺化合成N-烷基糠胺尚未見報道。源于Aspergillus aryzae的還原胺化酶(Asp Red Am)具有較寬的底物譜。基于上述情況,本論文探究了Asp Red Am催化生物基呋喃還原胺化的可行性,并基于分子對接分析,對Asp Red Am進行半理性分子改造以提高其催化生物基N-烷基糠胺合成效率;研究了還原胺化酶Asp Red Am催化羰基還原的多功能性。本研究取得的主要結果如下:1.Asp Red Am催化生物基呋喃還原胺化及分子改造。Asp Red Am不僅能催化HMF與正丙胺進行還原胺化,而且還展現出催化HMF...

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【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 緒論
    1.1 生物基呋喃
        1.1.1 5-羥甲基糠醛
        1.1.2 糠醛
    1.2 胺類化合物
    1.3 還原胺化
        1.3.1 化學催化還原胺化
        1.3.2 生物催化還原胺化
    1.4 還原胺化酶的性質、結構及分子改造
        1.4.1 還原胺化酶的性質
        1.4.2 還原胺化酶的結構
        1.4.3 還原胺化酶的分子改造
    1.5 本研究的主要內容和意義
第二章 AspRedAm催化生物基呋喃還原胺化與其分子改造
    2.1 實驗材料
        2.1.1 菌株和質粒
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 培養(yǎng)基配制
    2.2 實驗設備
    2.3 實驗方法
        2.3.1 重組表達載體的構建及鑒定
        2.3.2 重組菌E.coliBL21(DE3)/pET28a-AspRedAm的誘導表達
        2.3.3 還原胺化酶AspRedAm的分離純化
        2.3.4 還原胺化酶AspRedAm催化HMF還原胺化可行性研究
        2.3.5 生物基N-烷基糠胺的化學合成
        2.3.6 底物摩爾比對AspRedAm催化HMF和正丙胺還原胺化的影響
        2.3.7 反應溫度對AspRedAm催化HMF和正丙胺還原胺化的影響
        2.3.8 酶濃度對AspRedAm催化HMF和正丙胺還原胺化的影響
        2.3.9 生物催化5-[(丙胺基)甲基]-2-呋喃甲醇的放大合成
        2.3.10 高效液相色譜分析及1HNMR表征
        2.3.11 還原胺化酶AspRedAm與底物HMF的分子對接
        2.3.12 還原胺化酶AspRedAm突變體的獲取
        2.3.13 AspRedAm突變體的誘導表達及分離純化
        2.3.14 AspRedAm突變體催化HMF和正丙胺還原胺化的研究
        2.3.15 AspRedAm及突變體W210F和 L173N的酶活測定
        2.3.16 AspRedAm及突變體W210F與產物的分子對接
        2.3.17 AspRedAm及突變體W210F催化糠醛的還原胺化
        2.3.18 生物催化N-正丙基-2-糠胺的放大合成
    2.4 結果與討論
        2.4.1 重組表達載體的構建
        2.4.2 還原胺化酶AspRedAm的表達及分離純化
        2.4.3 還原胺化酶AspRedAm催化HMF還原胺化可行性分析
        2.4.4 底物摩爾比對AspRedAm催化HMF和正丙胺還原胺化的影響
        2.4.5 反應溫度對AspRedAm催化HMF和正丙胺還原胺化的影響
        2.4.6 酶濃度對AspRedAm催化HMF和正丙胺還原胺化的影響
        2.4.7 生物催化5-[(丙胺基)甲基]-2-呋喃甲醇的放大合成
        2.4.8 還原胺化酶AspRedAm突變位點的確定
        2.4.9 還原胺化酶AspRedAm突變體的獲取
        2.4.10 AspRedAm突變體催化HMF和正丙胺還原胺化的研究
        2.4.11 AspRedAm及突變體W210F和 L173N的酶活測定
        2.4.12 AspRedAm及突變體W210F與產物的對接結果
        2.4.13 AspRedAm及突變體W210F催化糠醛的還原胺化
        2.4.14 生物催化N-正丙基-2-糠胺的放大合成
    2.5 本章小結
第三章 還原胺化酶AspRedAm的催化多功能性研究
    3.1 實驗材料
        3.1.1 菌株和培養(yǎng)基
        3.1.2 主要試劑
    3.2 實驗設備
    3.3 實驗方法
        3.3.1 AspRedAm及突變體N93A和 N93S的誘導表達及分離純化
        3.3.2 AspRedAm及突變體N93A和 N93S的蛋白濃度及酶活測定
        3.3.3 AspRedAm及突變體N93A輔酶依賴性的研究
        3.3.4 AspRedAm及突變體N93A最適pH的研究
        3.3.5 AspRedAm及突變體N93A最適溫度和溫度穩(wěn)定性研究
        3.3.6 金屬離子對AspRedAm及突變體N93A酶活的影響
        3.3.7 AspRedAm及突變體N93A的底物特異性研究
        3.3.8 AspRedAm及突變體N93A的反應動力學研究
        3.3.9 AspRedAm及突變體N93A與底物HMF的分子對接
        3.3.10 AspRedAm及突變體N93A催化呋喃醛還原
        3.3.11 高效液相色譜分析
    3.4 結果與討論
        3.4.1 AspRedAm及突變體N93A和 N93S的還原活性
        3.4.2 AspRedAm及突變體N93A的輔酶依賴性
        3.4.3 AspRedAm及突變體N93A的最適pH
        3.4.4 AspRedAm及突變體N93A的最適溫度和溫度穩(wěn)定性
        3.4.5 金屬離子對AspRedAm及突變體N93A酶活的影響
        3.4.6 AspRedAm及突變體N93A的底物特異性
        3.4.7 AspRedAm及突變體N93A的反應動力學研究
        3.4.8 AspRedAm及突變體N93A與底物HMF的對接結果
        3.4.9 AspRedAm及突變體N93A催化呋喃醛還原
    3.5 本章小結
結論與展望
參考文獻
附錄
    附錄1 基因序列
    附錄2 校正曲線
    附錄3 液相色譜圖
    附錄4 ¹H NMR圖譜
攻讀碩士學位期間取得的研究成果
致謝
附件



本文編號：3966015