發(fā)布時(shí)間：2023-10-02 01:36

　　細(xì)胞色素P450單加氧酶(Cytochrome P450 monooxygenases)是一種廣泛存在于自然界中的亞鐵血紅素–硫醇鹽蛋白超家族,可催化羥基化、環(huán)氧化和O-脫烷基等多種類型的反應(yīng),特別是其可以在溫和條件下,催化復(fù)雜化合物中惰性C-H鍵的區(qū)域和立體選擇性氧化反應(yīng),從而實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)化學(xué)反應(yīng)難以實(shí)現(xiàn)的各類合成反應(yīng),因而其在有機(jī)合成,藥物合成等方面具有很高的應(yīng)用價(jià)值。為豐富P450酶作為合成生物學(xué)的酶元件庫(kù)、探索新型催化反應(yīng)進(jìn)一步提高P450酶的應(yīng)用價(jià)值,本研究利用生物信息學(xué)手段挖掘到來(lái)自兩種不同菌株(Sphingomonas wittichii RW1和Variovorax paradoxus S110)的細(xì)胞色素P450單加氧酶并對(duì)它們進(jìn)行異源表達(dá)和催化特性分析,主要研究結(jié)果如下:分別對(duì)這兩種不同來(lái)源的P450酶進(jìn)行異源表達(dá),發(fā)現(xiàn)只有來(lái)源于Variovorax paradoxus S110菌株中的P450酶能在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)異源可溶表達(dá),以下稱之為P450_VpMO。對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行分析并與其他已報(bào)道的P450家族蛋白氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)該酶屬于P450酶CY...

【文章頁(yè)數(shù)】：64 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 P450酶概述
        1.1.1 P450酶的來(lái)源及命名
        1.1.2 P450酶分類
    1.2 P450酶的催化反應(yīng)機(jī)制以及反應(yīng)類型
        1.2.1 P450酶的催化反應(yīng)機(jī)制
        1.2.2 P450酶的催化反應(yīng)類型
    1.3 P450酶的功能
    1.4 P450酶的應(yīng)用
        1.4.1 P450酶在醫(yī)藥中應(yīng)用
        1.4.2 P450酶與環(huán)境污染物
        1.4.3 P450酶在農(nóng)業(yè)中應(yīng)用
        1.4.4 P450酶在實(shí)際應(yīng)用中遇到問(wèn)題
    1.5 CYP116B家族P450酶的研究現(xiàn)狀
    1.6 Variovorax sp.功能簡(jiǎn)介
        1.6.1 有機(jī)硫化合物代謝與Variovorax sp.
        1.6.2 除草劑代謝與Variovorax sp.
        1.6.3 工業(yè)污染物代謝與Variovorax sp.
        1.6.4 Variovorax sp.與P450酶
    1.7 本論文立題依據(jù)以及研究?jī)?nèi)容
        1.7.1 立題依據(jù)
        1.7.2 本論文的主要研究?jī)?nèi)容
第二章 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 菌種與質(zhì)粒
        2.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器
        2.1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑及來(lái)源
        2.1.4 主要培養(yǎng)基
    2.2 分析方法
        2.2.1 菌體濃度測(cè)定方法
        2.2.2 蛋白濃度測(cè)定方法
        2.2.3 光譜學(xué)性質(zhì)測(cè)定方法(一氧化碳示差法)
        2.2.4 P450_VpMO酶活力的測(cè)定
        2.2.5 SDS-PAGE檢測(cè)分析方法
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 P450_VpMO目的基因與表達(dá)載體的克隆及酶連
        2.3.2 膠回收方法
        2.3.3 大腸桿菌Top10 以及BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞制備與質(zhì)粒轉(zhuǎn)化
        2.3.4 菌液PCR驗(yàn)證以及質(zhì)粒抽提方法
        2.3.5 目的蛋白表達(dá)與純化方法
        2.3.6 蛋白的濃縮
        2.3.7 鎳柱的重生
        2.3.8 酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定
        2.3.9 重組P450_VpMO底物譜測(cè)試
第三章 結(jié)果與討論
    3.1 質(zhì)粒構(gòu)建與蛋白表達(dá)純化
        3.1.1 P450spwi01與P450Vp MO的質(zhì)粒構(gòu)建及蛋白表達(dá)純化
        3.1.2 P450_VpMO質(zhì)粒構(gòu)建及蛋白表達(dá)純化
    3.2 重組P450_VpMO光譜學(xué)性質(zhì)的鑒定
    3.3 重組P450_VpMO系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建
    3.4 重組P450_VpMO酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定
        3.4.1 p H與溫度對(duì)重組P450Vp MO酶活力的影響
        3.4.2 重組P450_VpMO溫度穩(wěn)定性
        3.4.3 重組P450_VpMO動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定
    3.5 重組P450_VpMO的底物譜探索
        3.5.1 重組P450_VpMO對(duì)硫醚類物質(zhì)的氧化
        3.5.2 重組P450_VpMO對(duì)苯乙烯的催化
        3.5.3 重組P450_VpMO羥基化作用
        3.5.4 重組P450Vp MO O-脫烷基反應(yīng)
        3.5.5 重組P450_VpMO對(duì)苯胺類物質(zhì)反應(yīng)測(cè)試
        3.5.6 重組P450_VpMO對(duì)抗生素的降解測(cè)試
主要結(jié)論與展望
    主要結(jié)論
    展望
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄1 :作者在攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文
附錄2 :本文中相關(guān)反應(yīng)的液相色譜圖



本文編號(hào)：3849840