溶菌酶,又稱N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶,是一種能水解微生物細(xì)胞壁黏多糖的堿性水解酶,其廣泛分布于不同生物體中。溶菌酶作為天然的蛋白質(zhì),對動(dòng)物無害,無毒,不會(huì)殘留在體內(nèi)。海參i-型溶菌酶基因由本實(shí)驗(yàn)室于2007年首次分離和鑒定,并已將其目的蛋白分別在原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中高效表達(dá)。本課題以實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建并表達(dá)的海參i-型溶菌酶蛋白的畢赤酵母基因工程菌HS3-1為發(fā)酵出發(fā)菌株。首先采用5 L發(fā)酵罐對基因工程菌HS3-1進(jìn)行發(fā)酵小試,種子培養(yǎng)階段使用YPD和BMGY培養(yǎng)基,BSM為發(fā)酵罐培養(yǎng)基。發(fā)酵罐各參數(shù)設(shè)定為溫度30℃,pH 6.0,攪拌速度500 rpm/min,溶氧30%。種子液在發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中,當(dāng)BSM培養(yǎng)基中甘油耗盡后進(jìn)入甘油補(bǔ)料階段,其補(bǔ)料的速度為18.15 mL/h/L,時(shí)間為5 h。當(dāng)菌體濕重達(dá)到180-220 g/L時(shí),酵母細(xì)胞饑餓1 h。最后進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)階段,利用甲醇檢測器實(shí)時(shí)監(jiān)測發(fā)酵液中甲醇濃度,并將其控制在1%（V/V）,誘導(dǎo)時(shí)間為96 h。分析得到發(fā)酵液酶產(chǎn)量為58 mg/L,經(jīng)過鎳離子親和層析后得到海參溶菌酶精制產(chǎn)品,其酶活力為1238 U/mg。在5 L發(fā)酵罐的... 

【文章頁數(shù)】：76 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 緒論
    1.1 溶菌酶的簡介
        1.1.1 溶菌酶的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)
        1.1.2 溶菌酶的基因結(jié)構(gòu)
        1.1.3 溶菌酶的生物學(xué)功能
        1.1.4 溶菌酶的分類
    1.2 溶菌酶的應(yīng)用
        1.2.1 溶菌酶在食品中的應(yīng)用
        1.2.2 溶菌酶在養(yǎng)殖中的應(yīng)用
        1.2.3 溶菌酶在醫(yī)療中的應(yīng)用
    1.3 畢赤酵母的簡述
        1.3.1 畢赤酵母的應(yīng)用
        1.3.2 甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母的優(yōu)點(diǎn)
    1.4 溶菌酶的分離純化
        1.4.1 結(jié)晶法
        1.4.2 親和層析法
        1.4.3 超濾
        1.4.4 反膠團(tuán)萃取
    1.5 溶菌酶的純度檢測
        1.5.1 高效液相色譜法
        1.5.2 質(zhì)譜分析
    1.6 研究目的、內(nèi)容和技術(shù)路線
        1.6.1 研究目的和內(nèi)容
        1.6.2 技術(shù)路線
第二章 海參i-型溶菌酶5L和30L發(fā)酵及放大培養(yǎng)
    2.1 引言
    2.2 材料及儀器
        2.2.1 種子液培養(yǎng)基
        2.2.2 發(fā)酵罐培養(yǎng)基
        2.2.3 蛋白分離純化常用溶液和緩沖溶液
        2.2.4 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備
    2.3 發(fā)酵罐(5L)發(fā)酵培養(yǎng)
        2.3.1 電極的校正
        2.3.2 接種及初始培養(yǎng)
        2.3.3 甘油流加階段
        2.3.4 甲醇誘導(dǎo)階段
        2.3.5 海參i-型溶菌酶的純化
        2.3.6 抑菌活性分析方法
    2.4 發(fā)酵罐(30L)發(fā)酵培養(yǎng)
        2.4.1 發(fā)酵罐的滅菌
        2.4.2 接種及基礎(chǔ)生長階段
        2.4.3 甘油流加階段
        2.4.4 甲醇誘導(dǎo)階段
        2.4.5 i-型溶菌酶蛋白的分離與純化
        2.4.6 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析
        2.4.7 溶菌酶酶活檢測
    2.5 結(jié)果與分析
        2.5.1 發(fā)酵罐(5L)發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)果
        2.5.2 發(fā)酵罐(30L)發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)果
    2.6 本章小結(jié)
第三章 海參i-型溶菌酶液相和質(zhì)譜分析
    3.1 引言
    3.2 材料及儀器
        3.2.1 樣品
        3.2.2 儀器與試劑
        3.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
        3.2.4 樣品溶液的配制
        3.2.5 液相色譜條件
        3.2.6 高效液相色譜測定
        3.2.7 質(zhì)譜分析
    3.3 試驗(yàn)步驟
        3.3.1 高效液相色譜使用方法
        3.3.2 MALDI-TOF質(zhì)譜儀使用方法
    3.4 結(jié)果與分析
        3.4.1 高效液相測定與分析
        3.4.2 MALDI-TOF質(zhì)譜測定與分析
    3.5 本章小結(jié)
第四章 海參i-型溶菌酶酶學(xué)性質(zhì)及空間結(jié)構(gòu)研究
    4.1 引言
    4.2 儀器與試劑
        4.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備
        4.2.2 藥品與試劑
    4.3 方法與步驟
        4.3.1 溶菌酶活性測定
        4.3.2 pH對溶菌酶活性及穩(wěn)定性的影響
        4.3.3 溫度對溶菌酶活性及穩(wěn)定性的影響
        4.3.4 金屬離子對溶菌酶活性的影響
        4.3.5 常用助溶劑對溶菌酶活性的影響
        4.3.6 米氏常數(shù)(Km)測定
    4.4 結(jié)果與分析
        4.4.1 pH對溶菌酶活性及穩(wěn)定性影響的測定與分析
        4.4.2 溫度對溶菌酶活性及穩(wěn)定性影響的測定與分析
        4.4.3 金屬離子對溶菌酶活性的影響
        4.4.4 常用試劑對溶菌酶活性的影響
        4.4.5 米氏常數(shù)測定
        4.4.6 最低抑菌濃度實(shí)驗(yàn)
        4.4.7 海參i-型溶菌酶空間結(jié)構(gòu)研究
    4.5 本章小結(jié)
第五章 結(jié)論
討論與展望
參考文獻(xiàn)
研究生期間發(fā)表論文情況
致謝



本文編號(hào)：3684638