少動鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas elodea JLJ）發(fā)酵產(chǎn)生的結(jié)冷膠（gellan gum）是一種高分子線性陰離子型胞外莢膜多糖。其具有良好的耐熱性、耐酸堿性、無毒無害等性能,廣泛應(yīng)用于各種領(lǐng)域。在結(jié)冷膠發(fā)酵生產(chǎn)過程中,隨著結(jié)冷膠的積累,發(fā)酵液會變得越發(fā)粘稠,因此其發(fā)酵過程中的溶氧供需矛盾一直是一個亟待解決的嚴峻問題。本研究擬采用CRISPR/Cas9技術(shù)將透明顫菌血紅蛋白（vgb）基因敲入少動鞘氨醇單胞菌細胞內(nèi)改造其代謝網(wǎng)絡(luò),從而提高菌株攝取和利用氧的能力,解決結(jié)冷膠發(fā)酵過程中氧的供需矛盾,有效提高結(jié)冷膠產(chǎn)量;對重組菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行改造,最終使得結(jié)冷膠的產(chǎn)量得到顯著提高。主要研究結(jié)果為:（1）通過PCR法擴增獲得乙酰基轉(zhuǎn)移酶基因（nat）片段,確定菌株JLJ基因組中存在nat基因,選定其為靶位點。（2）通過CRISPR/Cas9技術(shù)對菌株JLJ進行改造,將透明顫菌血紅蛋白基因（vgb）敲入基因組中,并將nat基因敲除,獲得重組菌株JLJ-vgb。PCR、SDS-PAGE以及CO差光譜分析均表明vgb基因已成功敲入菌株JLJ基因組中,并成功表達有活性的血紅蛋... 

【文章來源】：內(nèi)蒙古大學內(nèi)蒙古自治區(qū)211工程院校

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻綜述
    1 結(jié)冷膠研究進展
        1.1 少動鞘氨醇單胞菌
        1.2 結(jié)冷膠
            1.2.1 概述
            1.2.2 結(jié)冷膠的結(jié)構(gòu)
            1.2.3 結(jié)冷膠的理化性質(zhì)
            1.2.4 結(jié)冷膠的體內(nèi)合成過程
            1.2.5 結(jié)冷膠發(fā)酵的研究
            1.2.6 結(jié)冷膠的應(yīng)用
        1.3 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的概述
            1.3.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在細菌中的工作原理
        1.4 透明顫菌血紅蛋白
            1.4.1 概述
            1.4.2 透明顫菌血紅蛋白（VHb）的結(jié)構(gòu)
        1.5 乙酰基轉(zhuǎn)移酶（nat）基因
        1.6 本文研究意義及內(nèi)容
第二章 結(jié)冷膠生產(chǎn)菌株代謝工程改造
    1 引言
    2 實驗材料
        2.1 菌株與質(zhì)粒
        2.2 主要儀器設(shè)備
        2.3 主要試劑
        2.4 培養(yǎng)基
        2.5 主要溶液的配制
    3 實驗方法及步驟
        3.1 結(jié)冷膠生產(chǎn)菌株的培養(yǎng)
        3.2 透明顫菌的培養(yǎng)
        3.3 引物設(shè)計
        3.4 菌株基因組DNA的提取
        3.5 乙�；D(zhuǎn)移酶基因（nat）的克隆
        3.6 克隆基因片段的膠回收
        3.7 感受態(tài)大腸桿菌的制備
        3.8 p MD19-T-nat的構(gòu)建
        3.9 p EASY-Blunt Zero-nvn克隆載體的構(gòu)建
            3.9.1 乙酰基轉(zhuǎn)移酶（nat）基因上下游同源臂的克隆
            3.9.2 透明顫菌血紅蛋白基因（vgb）的克隆
            3.9.3 一步重疊PCR
            3.9.4 克隆載體p EASY-Blunt Zero-nvn的構(gòu)建
        3.10 表達載體p Target F-New-vgb的構(gòu)建
        3.11 少動鞘氨醇單胞菌JLJ感受態(tài)細胞的制備
        3.12 電轉(zhuǎn)化少動鞘氨醇單胞菌JLJ
        3.13 重組菌株JLJ-vgb中質(zhì)粒的消除
        3.14 重組菌株JLJ-vgb的鑒定
            3.14.1 PCR鑒定
            3.14.2 SDS-PAGE分析
            3.14.3 VHb活性的測定——CO差光譜法
            3.14.4 重組菌株的傳代培養(yǎng)
            3.14.5 重組菌株穩(wěn)定性檢測
        3.15 結(jié)冷膠產(chǎn)量的測定
        3.16 發(fā)酵培養(yǎng)基中生物量的測定
        3.17 重組菌株發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵工藝的優(yōu)化
            3.17.1 單因素實驗
            3.17.2 響應(yīng)面法優(yōu)化實驗
    4 結(jié)果與分析
        4.1 結(jié)冷膠生產(chǎn)菌株的改造
            4.1.1 基因敲入靶位點的克隆
            4.1.2 pEASY-Blunt Zero-nvn克隆載體的構(gòu)建
                4.1.2.1 乙�；D(zhuǎn)移酶（nat）基因上下游同源臂的克隆
                4.1.2.2 vgb基因的克隆
                4.1.2.3 一步重疊PCR
            4.1.3 表達載體p arget F-New-vgb的構(gòu)建
            4.1.4 重組菌株JLJ-vgb的獲得及鑒定
                4.1.4.1 PCR鑒定
                4.1.4.2 SDS-PAGE分析
                4.1.4.3 VHb蛋白活性的檢測
                4.1.4.4 重組菌株JLJ-vgb穩(wěn)定性分析
        4.2 重組菌株JLJ-vgb發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵工藝的優(yōu)化
            4.2.1 碳源種類及濃度的優(yōu)化
            4.2.2 氮源種類及濃度的優(yōu)化
            4.2.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化
            4.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化實驗
                4.2.4.1 響應(yīng)面法實驗設(shè)計及模型建立
                4.2.4.2 模型 3D及等高線分析
                4.2.4.3 模型的驗證
    5 結(jié)論
參考文獻
致謝
附錄一 乙酰基轉(zhuǎn)移酶基因序列
附錄二 pEASY-Blunt Zero-nvn部分基因序列
附錄三 pTarget F-New反向PCR部分基因序列
附錄四 pTarget F-New-vgb表達載體部分基因序列
附錄五 重組菌株JLJ-vgb vgb基因序列


【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
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本文編號：3639040