外切葡聚糖纖維二糖水解酶I基因（cellobiohydrolase I,cbh1）的啟動子是一個受纖維素誘導的強誘導型啟動子,可以實現(xiàn)目的基因定時、定量的表達,被認為是構建真核表達載體的理想選擇,也是目前唯一被報道應用于絲狀真菌CRISPR系統(tǒng)的誘導型啟動子。產(chǎn)油真菌高山被孢霉（Mortierella alpina）在工業(yè)上被用于生產(chǎn)花生四烯酸（Arachidonic acid,AA）,其發(fā)酵過程可以明顯分為細胞增殖期和脂質(zhì)積累期兩個階段。然而,目前常規(guī)的組成型啟動子無法根據(jù)高山被孢霉的發(fā)酵產(chǎn)脂特點對目的基因進行人為地高效調(diào)控,條件性地控制基因表達的工具亟待開發(fā)。本論文以ω-3脂肪酸脫飽和酶基因oPpFADS17作為報告基因,通過構建含有異源誘導型啟動子cbh1的高山被孢霉重組菌株MA-Pcbh1-oPp FADS17,探究了誘導型啟動子cbh1在高山被孢霉中應用的可行性并對其誘導條件進行多方面的優(yōu)化。此外,還通過基于GC-MS的代謝組學研究方法對重組菌的代謝物進行分析,確定了啟動子cbh1誘導活性變化的生物標志物。本文的主要結果如下:1.在野生型高山被孢霉ATCC 32222基因組數(shù)... 

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纖維素酶對纖維素的降解過程

江南大學碩士學位論文10導型啟動子。因此，本研究嘗試將啟動子cbh1應用于高山被孢霉，為高山被孢霉的基礎研究和工程菌株的開發(fā)提供高效調(diào)控基因表達的分子工具。1.4.2主要研究內(nèi)容本課題的主要研究內(nèi)容如下：1．通過對文獻進行查閱確定纖維素在降解過程中涉及的纖維素酶并對高山被孢霉全基因組信息和轉錄組測序數(shù)據(jù)進行分析，查找其是否具有纖維素代謝相關酶基因并分析各個基因是否有轉錄。同時，將高山被孢霉在以微晶纖維素唯一碳源的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，觀察菌株對纖維素的利用情況，進一步確定高山被孢霉對纖維素的代謝能力。2．以ω-3脂肪酸脫飽和酶基因oPpFADS17為報告基因，構建重組質(zhì)粒pBIG2-ura5s-Pcbh1-oPpFADS17-Trpct，并利用根癌農(nóng)桿菌介導的轉化方法將重組質(zhì)粒轉入高山被孢霉中，通過對重組菌EPA含量及oPpFADS17基因的轉錄水平確定啟動子cbh1在高山被孢霉中的誘導性。3．針對高山被孢霉重組菌株誘導培養(yǎng)時的誘導劑種類、誘導劑濃度及額外碳源葡萄糖的濃度對誘導條件進行優(yōu)化。4．通過對高山被孢霉重組菌株的代謝產(chǎn)物進行分析，探究啟動子cbh1對高山被孢霉重組菌株的影響并確定具有關鍵誘導作用的代謝物。技術路線如圖1-3所示。圖1-3技術路線圖Figure.1-3Technologyroadmap

江南大學碩士學位論文 3.1.1.2 高山被孢霉在添加纖維素培養(yǎng)基中的生長分析 為了進一步確定高山被孢霉對纖維素代謝能力，將野生型高山被孢霉接種于以微晶纖維素作為唯一碳源的 Broth 培養(yǎng)基中，以不含微晶纖維素的 Broth 培養(yǎng)基作為陰性對照。28℃培養(yǎng) 7 天后，收集菌體測定生物量。在培養(yǎng)過程中，觀察到隨著高山被孢霉培養(yǎng)時間的延長，不溶性的微晶纖維素的含量在不斷減少。添加微晶纖維素組的高山被孢霉產(chǎn)生的生物量明顯高于對照組，提高了大約 50%（圖 3-1），表明高山被孢霉可以降解利用纖維素并將其用于菌體的生長，纖維素代謝相關基因在高山被孢霉中進行了翻譯表達，菌株中合成了可以分解纖維素的酶，高山被孢霉具備啟動子 cbh1 應用的生物基礎。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]絲狀真菌纖維素酶合成誘導及轉錄調(diào)控[J]. 張飛,白鳳武,趙心清.  生物工程學報. 2016(11)
[2]內(nèi)切葡聚糖酶基因克隆和表達研究進展[J]. 黃國昌,熊大維,顧斌濤.  江西科學. 2016(01)
[3]真菌產(chǎn)纖維素酶的誘導物及其調(diào)控機理研究進展[J]. 謝天文,劉曉風,袁月祥,閆志英,賀蓉娜,廖銀章.  應用與環(huán)境生物學報. 2010(03)
[4]工業(yè)發(fā)酵中溶氧因素的探討[J]. 張智,滕婷婷,王淼,邵菊芳.  中國釀造. 2008(23)
[5]重組枯草芽孢桿菌谷氨酰胺合成酶蛋白在改良M9培養(yǎng)基中的誘導表達[J]. 劉順誼,殷志敏.  南京師大學報(自然科學版). 2007(04)

博士論文
[1]Δ6脂肪酸脫飽和酶底物選擇性研究及其在高山被孢霉中的應用[D]. 史海粟.江南大學 2016
[2]高山被孢霉脂肪酸合成過程轉錄水平調(diào)控和還原力來源研究[D]. 郝光飛.江南大學 2014
[3]產(chǎn)油真菌高山被孢霉的脂質(zhì)合成機理研究[D]. 王鴻超.江南大學 2013

碩士論文
[1]鐵脅迫及強啟動子A4插入對黃色鏈霉菌TRM45540次生代謝的影響[D]. 楊帥.塔里木大學 2019
[2]長野芽孢桿菌普魯蘭酶基因在枯草芽孢桿菌中的整合表達[D]. 王越.江南大學 2019
[3]雙基因共表達策略對高山被孢霉重組菌合成EPA的作用研究[D]. 張小可.江南大學 2018
[4]高山被孢霉生物合成共軛亞油酸重組菌株的構建及研究[D]. 郝丹輝.江南大學 2015
[5]啟動子cbh1的改造與里氏木霉通用質(zhì)粒載體的構建[D]. 唐偲洋.華東理工大學 2013
[6]多拷貝策略構建瑞氏木霉外源基因系列表達載體[D]. 劉倜.山東大學 2005
[7]分泌性表達人rPA畢赤酵母菌株的構建及發(fā)酵條件的優(yōu)化[D]. 鄧長江.山東大學 2005



本文編號：3615995