外切葡聚糖纖維二糖水解酶I基因（cellobiohydrolase I,cbh1）的啟動(dòng)子是一個(gè)受纖維素誘導(dǎo)的強(qiáng)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子,可以實(shí)現(xiàn)目的基因定時(shí)、定量的表達(dá),被認(rèn)為是構(gòu)建真核表達(dá)載體的理想選擇,也是目前唯一被報(bào)道應(yīng)用于絲狀真菌CRISPR系統(tǒng)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。產(chǎn)油真菌高山被孢霉（Mortierella alpina）在工業(yè)上被用于生產(chǎn)花生四烯酸（Arachidonic acid,AA）,其發(fā)酵過程可以明顯分為細(xì)胞增殖期和脂質(zhì)積累期兩個(gè)階段。然而,目前常規(guī)的組成型啟動(dòng)子無法根據(jù)高山被孢霉的發(fā)酵產(chǎn)脂特點(diǎn)對(duì)目的基因進(jìn)行人為地高效調(diào)控,條件性地控制基因表達(dá)的工具亟待開發(fā)。本論文以ω-3脂肪酸脫飽和酶基因oPpFADS17作為報(bào)告基因,通過構(gòu)建含有異源誘導(dǎo)型啟動(dòng)子cbh1的高山被孢霉重組菌株MA-Pcbh1-oPp FADS17,探究了誘導(dǎo)型啟動(dòng)子cbh1在高山被孢霉中應(yīng)用的可行性并對(duì)其誘導(dǎo)條件進(jìn)行多方面的優(yōu)化。此外,還通過基于GC-MS的代謝組學(xué)研究方法對(duì)重組菌的代謝物進(jìn)行分析,確定了啟動(dòng)子cbh1誘導(dǎo)活性變化的生物標(biāo)志物。本文的主要結(jié)果如下:1.在野生型高山被孢霉ATCC 32222基因組數(shù)... 

【文章來源】：江南大學(xué)江蘇省211工程院校教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：69 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

纖維素酶對(duì)纖維素的降解過程

江南大學(xué)碩士學(xué)位論文10導(dǎo)型啟動(dòng)子。因此，本研究嘗試將啟動(dòng)子cbh1應(yīng)用于高山被孢霉，為高山被孢霉的基礎(chǔ)研究和工程菌株的開發(fā)提供高效調(diào)控基因表達(dá)的分子工具。1.4.2主要研究內(nèi)容本課題的主要研究內(nèi)容如下：1．通過對(duì)文獻(xiàn)進(jìn)行查閱確定纖維素在降解過程中涉及的纖維素酶并對(duì)高山被孢霉全基因組信息和轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，查找其是否具有纖維素代謝相關(guān)酶基因并分析各個(gè)基因是否有轉(zhuǎn)錄。同時(shí)，將高山被孢霉在以微晶纖維素唯一碳源的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，觀察菌株對(duì)纖維素的利用情況，進(jìn)一步確定高山被孢霉對(duì)纖維素的代謝能力。2．以ω-3脂肪酸脫飽和酶基因oPpFADS17為報(bào)告基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒pBIG2-ura5s-Pcbh1-oPpFADS17-Trpct，并利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入高山被孢霉中，通過對(duì)重組菌EPA含量及oPpFADS17基因的轉(zhuǎn)錄水平確定啟動(dòng)子cbh1在高山被孢霉中的誘導(dǎo)性。3．針對(duì)高山被孢霉重組菌株誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)的誘導(dǎo)劑種類、誘導(dǎo)劑濃度及額外碳源葡萄糖的濃度對(duì)誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化。4．通過對(duì)高山被孢霉重組菌株的代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，探究啟動(dòng)子cbh1對(duì)高山被孢霉重組菌株的影響并確定具有關(guān)鍵誘導(dǎo)作用的代謝物。技術(shù)路線如圖1-3所示。圖1-3技術(shù)路線圖Figure.1-3Technologyroadmap

江南大學(xué)碩士學(xué)位論文 3.1.1.2 高山被孢霉在添加纖維素培養(yǎng)基中的生長分析 為了進(jìn)一步確定高山被孢霉對(duì)纖維素代謝能力，將野生型高山被孢霉接種于以微晶纖維素作為唯一碳源的 Broth 培養(yǎng)基中，以不含微晶纖維素的 Broth 培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。28℃培養(yǎng) 7 天后，收集菌體測定生物量。在培養(yǎng)過程中，觀察到隨著高山被孢霉培養(yǎng)時(shí)間的延長，不溶性的微晶纖維素的含量在不斷減少。添加微晶纖維素組的高山被孢霉產(chǎn)生的生物量明顯高于對(duì)照組，提高了大約 50%（圖 3-1），表明高山被孢霉可以降解利用纖維素并將其用于菌體的生長，纖維素代謝相關(guān)基因在高山被孢霉中進(jìn)行了翻譯表達(dá)，菌株中合成了可以分解纖維素的酶，高山被孢霉具備啟動(dòng)子 cbh1 應(yīng)用的生物基礎(chǔ)。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
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[4]高山被孢霉生物合成共軛亞油酸重組菌株的構(gòu)建及研究[D]. 郝丹輝.江南大學(xué) 2015
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