高山被孢霉（Mortierella alpina）是一株高產(chǎn)花生四烯酸的絲狀真菌,已被廣泛用于工業(yè)生產(chǎn)花生四烯酸。目前高山被孢霉的基因組、轉(zhuǎn)錄組、脂質(zhì)組信息已明確,基于上述信息,為進(jìn)一步解析其產(chǎn)脂積累過程并構(gòu)建高產(chǎn)脂菌株,單基因與雙基因改造手段已不能滿足研究需求,而多基因操作系統(tǒng)在高山被孢霉中的構(gòu)建和應(yīng)用未有報(bào)道。規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）系統(tǒng)是一種功能強(qiáng)大且應(yīng)用廣泛的靶向基因敲除工具。通過誘導(dǎo)型啟動(dòng)子作用下的CRISPR系統(tǒng)對(duì)靶向基因如篩選標(biāo)記進(jìn)行反復(fù)誘導(dǎo)敲除,可以實(shí)現(xiàn)憑借單一篩選標(biāo)記完成對(duì)宿主菌的多基因改造。還原力NADPH是產(chǎn)油微生物產(chǎn)脂過程所必需的成分,對(duì)脂質(zhì)積累影響顯著。本論文在高山被孢霉中構(gòu)建了基于CRISPR系統(tǒng)的多基因表達(dá)策略,挖掘并篩選NADPH供應(yīng)途徑中的關(guān)鍵酶,并通過該系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了NADPH供應(yīng)關(guān)鍵基因的導(dǎo)入以及篩選標(biāo)記的二次回收,證明了該系統(tǒng)在高山被孢霉中的成功應(yīng)用。本論文主要研究?jī)?nèi)容和實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1.高山被孢霉轉(zhuǎn)化效率的提升。為便... 

【文章來源】：江南大學(xué)江蘇省211工程院校教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：95 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

CRISPR/cas系統(tǒng)法作用機(jī)制示意圖

第二章不同根癌農(nóng)桿菌種類和高山被孢霉細(xì)胞形態(tài)對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響25RT-VirE1-F:ATGGCCATCATCAAGCRT-VirE1-R:GAGCGGGCACCGATGGACAAART-16SrDNA-F:GTGTAGCGGTGAAATGCRT-16SrDNA-R:GTTTACGGCGTGGACTART-qPCR反應(yīng)體系為：cDNA1μLSYBRGreenSupermix10μL上游引物0.5μL下游引物0.5μLddH2O8μLRT-qPCR條件：95°C10min，95°C15s，60°C1min，30個(gè)循環(huán)。2.4結(jié)果與討論2.4.1不同根癌農(nóng)桿菌中驗(yàn)證二元質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化為探索不同根癌農(nóng)桿菌種類對(duì)高山被孢霉轉(zhuǎn)化效率的影響，將包含根癌農(nóng)桿菌篩選標(biāo)記卡那霉素片段和高山被孢霉篩選標(biāo)記尿嘧啶ura5的二元驗(yàn)證質(zhì)粒pBIG2-ura5-IT轉(zhuǎn)入四種根癌農(nóng)桿菌AGL-1、C58C1、EHA105和LBA4404感受態(tài)中。挑選在含有抗生素Kana和Rif的固體YEP平板上正常生長(zhǎng)的菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證。所用驗(yàn)證二元質(zhì)粒為實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建，其整合進(jìn)入高山被孢霉基因組的T-DNA區(qū)包含ura5片段和IT片段，可利用通用引物對(duì)HisproF1/TrpCR1進(jìn)行驗(yàn)證。陽性轉(zhuǎn)化子的PCR凝膠電泳結(jié)果應(yīng)顯示兩條目標(biāo)條帶，分別為ura5條帶（861bp）和IT條帶（389bp）。四種根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的PCR凝膠電泳結(jié)果（圖2-2）與理論一致，表明該驗(yàn)證二元質(zhì)粒已被成功轉(zhuǎn)入四種根癌農(nóng)桿菌。圖2-2PCR驗(yàn)證二元載體pBIG2-ura5-IT轉(zhuǎn)化四種根癌農(nóng)桿菌Fig.2-2PCRverificationofthetransformationofpBIG2-ura5-ITintofourA.tumefaciensstrains注：M:DNA標(biāo)尺，A:AGL-1，C:C58C1，E:EHA105，L:LBA4404，N:陰性對(duì)照，P:陽性對(duì)照。

第二章不同根癌農(nóng)桿菌種類和高山被孢霉細(xì)胞形態(tài)對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響27表2-3根癌農(nóng)桿菌中不同致毒因子的同源性分析Table2-3HomologyanalysisofdifferentvirgenesinAgrobacteriumtumefacience編號(hào)virA基因IDvirD1基因IDvirD2基因IDvirD4基因IDvirE1基因ID11224316638214812243336382151122433726381972122433263821491224335638215331224134395181713951922439518175395182064/39517457395166461224152395174775/395192233951817239517476395192766/39516688395175293951917339516558同源性91.15%89.99%85.29%90.07%86.25%注：ID號(hào)為NCBI數(shù)據(jù)庫中編號(hào)，編號(hào)1～6無實(shí)際意義，只代表基因的個(gè)數(shù)。為驗(yàn)證設(shè)計(jì)引物的專一性，以四種根癌農(nóng)桿菌菌液為底物，進(jìn)行PCR驗(yàn)證。PCR凝膠電泳結(jié)果（圖2-3）顯示，針對(duì)5種不同致毒因子設(shè)計(jì)的5對(duì)引物在四種根癌農(nóng)桿菌中均得到了大小相同的單一條帶，表明本論文設(shè)計(jì)的引物專一性強(qiáng)，可用于致毒因子轉(zhuǎn)錄水平的測(cè)定。圖2-3根癌農(nóng)桿菌中致毒因子的引物驗(yàn)證圖Fig.2-3TheelectrophoresisresultoftheprimersdesignedforvirgenesoftheAgrobacterium.注：M:DNA標(biāo)尺，A:AGL-1，C:C58C1，E:EHA105，L:LBA4404，N:陰性對(duì)照，目標(biāo)條帶大小為230bp（virA），174bp（virD1），251bp（virD2），326bp（virD4）和165bp（virE1）。在挑選的5種致毒因子中，除VirA屬于組成型蛋白外，其他4種致毒因子都屬于誘導(dǎo)型蛋白。在進(jìn)行高山被孢霉轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)時(shí)，根癌農(nóng)桿菌在加入誘導(dǎo)劑乙酰丁香酮（AS）12h后，才與高山被孢霉進(jìn)行共培養(yǎng)操作。因此，除virA外，在加入誘導(dǎo)劑AS的12h內(nèi)，每隔4h測(cè)定其余四種致毒因子virD1、virD2、virD4和virE1的轉(zhuǎn)錄水平變化。致

【參考文獻(xiàn)】：
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本文編號(hào)：3613456