發(fā)布時間：2022-01-08 19:20

　　鐵依賴的氧化應(yīng)激是指細(xì)胞中的鐵離子催化芬頓（Fenton）反應(yīng),造成脂質(zhì)過氧化物積累、蛋白質(zhì)變性和錯誤折疊的現(xiàn)象。熱休克蛋白70（Heat shock protein 70,HSP70）屬于應(yīng)激蛋白,可在細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)下幫助錯誤折疊蛋白重新折疊或降解保護(hù)細(xì)胞。然而,HSP70和鐵依賴的氧化應(yīng)激的關(guān)系尚不明確。多不飽和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acid,PUFA）是人體必需脂肪酸,膳食攝入的PUFA在鐵離子存在的情況下也會發(fā)生脂質(zhì)過氧化,細(xì)胞病理條件下會造成脂質(zhì)過氧化物積累。本研究主要探究在二十二碳六烯酸n-3系列多不飽和脂肪酸（Docosahexaenoic acid,DHA）疊加鐵死亡誘導(dǎo)劑erastin和RSL3誘導(dǎo)的PC3細(xì)胞的鐵依賴的氧化應(yīng)激模型中,HSP70家族中HSPA1A、HSPA8及HSPA9的作用以及可能的機(jī)制,從而為將鐵依賴的氧化應(yīng)激機(jī)制應(yīng)用于癌癥治療和神經(jīng)退行性等疾病的預(yù)防提供理論依據(jù)。主要結(jié)論如下:（1）通過構(gòu)建質(zhì)粒在胞內(nèi)過表達(dá)HSPA1A、HSPA8和HSPA9以及構(gòu)建小干擾RNA敲減HSPA8、HSPA9,采用MTT法測定細(xì)胞存活... 

【文章來源】：江南大學(xué)江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：60 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

DHA加劇erastin和RSL3誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡Figure1DHAexacerbateserastinandRSL3inducedcelldeath

3結(jié)果與討論17圖2HSP70抑制劑VER155008對鐵依賴的氧化應(yīng)激的影響Figure2EffectofHSP70inhibitorVER155008iniron-dependentoxidativestress3.1.2過表達(dá)HSPA1A、HSPA8、HSPA9對鐵依賴的氧化應(yīng)激中的作用已經(jīng)有報道表明HSP70家族中HSPA5蛋白對erastin誘導(dǎo)的PDAC細(xì)胞死亡有保護(hù)作用，這與我們HSP70抑制劑結(jié)果一致，但是也有文獻(xiàn)報道HSPA8在erastin誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞死亡中起抑制作用[84]，這我們的結(jié)論不同，需要進(jìn)一步探究，因此本實驗主要探究HSPA1A、HSPA8、HSPA9對鐵依賴的氧化應(yīng)激的作用。構(gòu)建HSPA1A、HSPA8、HSPA9過表達(dá)質(zhì)粒。載體選擇實驗室已有載體pEB，載體中含有GFP標(biāo)簽，GFP為非融合表達(dá)，在NCBI網(wǎng)站設(shè)計得到HSPA1A全長引物（RLQ78993.1），HSPA8全長引物（AOF45639.1），HSPA9全長引物（RLQ73870.1），使用高保真酶PCR擴(kuò)增HSPA1A、HSPA8、HSPA9片段，pEB載體雙酶切，轉(zhuǎn)化，挑單克隆搖菌提質(zhì)粒測序。測序正確以后，擴(kuò)大培養(yǎng)提取質(zhì)粒。質(zhì)粒提取后，轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，24h后提取細(xì)胞進(jìn)行WesternBlot。結(jié)果如圖3，說明質(zhì)粒能夠在細(xì)胞中表達(dá)目的蛋白，可用于鐵依賴的氧化應(yīng)激模型中進(jìn)行功能驗證。圖3過表達(dá)HSPA1A、HSPA8、HSPA9蛋白的驗證Figure3ValidationofoverexpressedHSPA1A、HSPA8、HSPA9proteins在96孔板中按1000個細(xì)胞/孔接入相應(yīng)細(xì)胞，12~24h內(nèi)完成轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24~48h以后通過熒光判斷轉(zhuǎn)染效率，用1%FBS的培養(yǎng)基中加入對應(yīng)刺激，PC3用250nMRSL3+15μMDHA或者5μMerastin+15μMDHA誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生鐵依賴的氧化應(yīng)激。

3結(jié)果與討論17圖2HSP70抑制劑VER155008對鐵依賴的氧化應(yīng)激的影響Figure2EffectofHSP70inhibitorVER155008iniron-dependentoxidativestress3.1.2過表達(dá)HSPA1A、HSPA8、HSPA9對鐵依賴的氧化應(yīng)激中的作用已經(jīng)有報道表明HSP70家族中HSPA5蛋白對erastin誘導(dǎo)的PDAC細(xì)胞死亡有保護(hù)作用，這與我們HSP70抑制劑結(jié)果一致，但是也有文獻(xiàn)報道HSPA8在erastin誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞死亡中起抑制作用[84]，這我們的結(jié)論不同，需要進(jìn)一步探究，因此本實驗主要探究HSPA1A、HSPA8、HSPA9對鐵依賴的氧化應(yīng)激的作用。構(gòu)建HSPA1A、HSPA8、HSPA9過表達(dá)質(zhì)粒。載體選擇實驗室已有載體pEB，載體中含有GFP標(biāo)簽，GFP為非融合表達(dá)，在NCBI網(wǎng)站設(shè)計得到HSPA1A全長引物（RLQ78993.1），HSPA8全長引物（AOF45639.1），HSPA9全長引物（RLQ73870.1），使用高保真酶PCR擴(kuò)增HSPA1A、HSPA8、HSPA9片段，pEB載體雙酶切，轉(zhuǎn)化，挑單克隆搖菌提質(zhì)粒測序。測序正確以后，擴(kuò)大培養(yǎng)提取質(zhì)粒。質(zhì)粒提取后，轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，24h后提取細(xì)胞進(jìn)行WesternBlot。結(jié)果如圖3，說明質(zhì)粒能夠在細(xì)胞中表達(dá)目的蛋白，可用于鐵依賴的氧化應(yīng)激模型中進(jìn)行功能驗證。圖3過表達(dá)HSPA1A、HSPA8、HSPA9蛋白的驗證Figure3ValidationofoverexpressedHSPA1A、HSPA8、HSPA9proteins在96孔板中按1000個細(xì)胞/孔接入相應(yīng)細(xì)胞，12~24h內(nèi)完成轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24~48h以后通過熒光判斷轉(zhuǎn)染效率，用1%FBS的培養(yǎng)基中加入對應(yīng)刺激，PC3用250nMRSL3+15μMDHA或者5μMerastin+15μMDHA誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生鐵依賴的氧化應(yīng)激。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[3]程序性細(xì)胞死亡形式研究進(jìn)展[J]. 胡艷紅,張凡,張楚焌,孫天石,蕫一昕,李衛(wèi)紅.  遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報. 2018(12)
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碩士論文
[1]小細(xì)胞肺癌多因素預(yù)后分析及預(yù)后模型的建立[D]. 郭寒菲.吉林大學(xué) 2019
[2]單不飽和脂肪酸在鐵死亡中的作用以及機(jī)制的研究[D]. 付國玲.江南大學(xué) 2018



本文編號：3577132