釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）可作為宿主生產(chǎn)多種藥用蛋白和工業(yè)酶等,近年來作為異源蛋白生產(chǎn)的宿主被廣泛研究。然而,由于釀酒酵母蛋白生產(chǎn)和分泌水平較低,限制了其實際應(yīng)用。釀酒酵母蛋白生產(chǎn)需要多基因協(xié)同作用,過量生產(chǎn)蛋白可能導(dǎo)致代謝脅迫,但對重組酵母蛋白生產(chǎn)的全局調(diào)控機制研究還不夠深入。本課題組前期在利用環(huán)境脅迫耐性關(guān)鍵基因改造釀酒酵母菌株的研究過程中,發(fā)現(xiàn)膜蛋白Mdg1p和與維持基因組穩(wěn)定性相關(guān)的蛋白Mhf1p在乙酸耐性提高的重組酵母中表達顯著上調(diào)。目前對這兩個蛋白的功能研究較少,其對異源蛋白生產(chǎn)的作用還不清楚。本研究利用基于CRISPR-Cas9的基因編輯技術(shù),在分泌表達纖維二糖水解酶（CBH）、內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的重組釀酒酵母菌株中分別過表達MDG1和MHF1基因,并對所獲得的重組酵母菌株產(chǎn)酶能力進行評價,進而初步探討了其作用機理。結(jié)果表明,分別過表達這兩個基因后均提高了重組酵母CBH的活性。此外,MDG1的過表達還提高了胞外內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的活性。利用實時定量PCR對蛋白分泌途徑相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平進行分析,結(jié)果表明,所獲得的重組酵... 

【文章來源】：大連理工大學(xué)遼寧省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：82 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
引言
1 緒論
    1.1 木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化及纖維素酶
        1.1.1 木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化及纖維素酶
        1.1.2 纖維素酶的組成、分類及功能
    1.2 異源蛋白在釀酒酵母中的表達和分泌
        1.2.1 釀酒酵母蛋白分泌途徑
        1.2.2 異源蛋白在釀酒酵母中的表達研究及其優(yōu)化策略
    1.3 本課題研究涉及的靶點基因
        1.3.1 MDG1基因功能相關(guān)研究
        1.3.2 MHF1基因功能相關(guān)研究
    1.4 本研究的目的意義和技術(shù)路線
2 MDG1基因過表達對重組酵母分泌纖維素酶的影響
    2.1 引言
    2.2 實驗材料
        2.2.1 實驗相關(guān)儀器設(shè)備
        2.2.2 實驗菌株
        2.2.3 實驗相關(guān)試劑
    2.3 實驗方法
        2.3.1 過表達載體的構(gòu)建
        2.3.2 過表達菌株的構(gòu)建與活化
        2.3.3 菌株酶活評價
        2.3.4 RNA提取及實時定量分析
        2.3.5 細胞膜透性評價方法
        2.3.6 細胞壁完整性評價方法
        2.3.7 細胞形態(tài)觀察
        2.3.8 總麥角甾醇含量的測定
        2.3.9 SDS-PAGE分析
        2.3.10 耐性平板比較實驗
    2.4 實驗結(jié)果
        2.4.1 MDG1過表達菌株構(gòu)建
        2.4.2 MDG1過表達提高了釀酒酵母中纖維素酶的產(chǎn)量
        2.4.3 MDG1過表達影響參與分泌途徑相關(guān)基因的表達
        2.4.4 MDG1過表達改變了宿主細胞的形態(tài)
        2.4.5 MDG1過表達改變了質(zhì)膜和細胞壁的特性
        2.4.6 MDG1過表達菌株內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫應(yīng)答表征
    2.5 討論
    2.6 本章小結(jié)
3 MHF1基因過表達對重組酵母分泌纖維素酶的影響
    3.1 引言
    3.2 實驗材料
        3.2.1 實驗相關(guān)儀器設(shè)備
        3.2.2 實驗菌株
        3.2.3 實驗相關(guān)試劑
    3.3 實驗方法
        3.3.1 菌株構(gòu)建與活化
        3.3.2 菌株酶活評價
        3.3.3 RNA提取及實時定量分析
        3.3.4 SDS-PAGE分析
        3.3.5 胞內(nèi)活性氧水平檢測
    3.4 實驗結(jié)果
        3.4.1 MHF1過表達菌株構(gòu)建
        3.4.2 MHF1過表達對重組酵母菌株酶活的影響
        3.4.3 MHF1過表達對重組酵母胞內(nèi)活性氧水平的影響
        3.4.4 MHF1過表達對重組酵母關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄的影響
        3.4.5 MHF1過表達菌株內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫應(yīng)答表征
    3.5 討論
    3.6 本章小結(jié)
結(jié)論
創(chuàng)新點
展望
參考文獻
附錄A 本論文涉及的基因序列
附表：本文使用主要引物序列
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文情況
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]過表達MRP8提高釀酒酵母乙酸耐性及乙醇發(fā)酵效率[J]. 萬春,萬青青,熊亮,趙心清,白鳳武.  生物加工過程. 2017(05)
[2]基于纖維小體展示技術(shù)的釀酒酵母纖維素乙醇研究進展[J]. 范立海,譚天偉.  中國科學(xué):化學(xué). 2014(01)
[3]鋅離子提高絮凝酵母乙酸脅迫耐受性[J]. 徐桂紅,趙心清,李寧,白鳳武.  化工學(xué)報. 2012(06)



本文編號：3577139