α-氨基己二酸（α-Aminoadipic acid,AAA）是一種非蛋白質(zhì)氨基酸。AAA是生物合成青霉素和頭孢菌素等β-內(nèi)酰胺抗生素的中間體,可用于化學(xué)合成抗風(fēng)濕和抗癌的甲氨蝶呤衍生物。它還可用作生理活性肽（如肽抗生素和肽激素）的末端修飾劑等。目前AAA主要通過化學(xué)法合成,這些方法存在產(chǎn)量低和成本高的問題。本論文首次實現(xiàn)了大腸桿菌從頭合成AAA,并通過系統(tǒng)代謝工程改造實現(xiàn)了產(chǎn)量的逐步提升。1、構(gòu)建賴氨酸到AAA的下游途徑:將釀酒酵母來源的賴氨酸酮戊二酸還原酶Lys1和酵母氨酸脫氫酶Lys9以及熱紅球菌來源的α-氨基己二酸半醛脫氫酶reAASADH引入大腸桿菌,通過添加前體賴氨酸實現(xiàn)了 α-氨基己二酸的生產(chǎn)。通過基因模塊優(yōu)化對三個酶的表達水平進行調(diào)節(jié),將優(yōu)化后的質(zhì)粒表達組合轉(zhuǎn)入BW25113在M10培養(yǎng)基發(fā)酵,從頭合成α-氨基己二酸 249.93 mg·mL-1。2、增加前體賴氨酸的供應(yīng):通過敲除賴氨酸脫羧酶的編碼基因（cadA和ldcC）,減少賴氨酸的降解;對賴氨酸合成過程中的限速酶天冬氨酸激酶和4-羥基-四氫二吡啶甲酸合酶DapA進行過表達,產(chǎn)量提高至453.73 mg·mL-1。... 

【文章來源】：北京化工大學(xué)北京市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：93 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－１代表性非蛋白質(zhì)氨基酸的代謝網(wǎng)絡(luò)Ｍ??Ｆｉｇ．?１－１?Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ?ｎ?

－＾?＾Ａｓｄ?ＤａｐＡ?＼?＼＿／??ｃｏｃＴ?ｃｏｃＴ?＇ｃｏｃＴ?－〇〇ｃ廣?＂ｏｏｃ??？ＯＯＣ?ＯＯＣ?＿ｏｏｃ?ｏｏｃ?＋?ｈ３ｎ??ＣｏＡＳＨ?ＮＨ－Ｓｊｃｃ?ｙ—ＮＨ－Ｓｕｃｃ?）—ＫＨ３?Ｖ—ＮＨ３?＼??＾?ｆｒｒ?ｆ?－Ｓｒ??／?Ｃｉｌｕｌａｍａｔｃ?２－Ｏｊｃｏ＾ｌｉａａｉａｕ：?（?＼?＼?＼??＼＝〇?＿?／－ＮＨ３?ｙ—ＮＨ３?＿?ＮＨ３?＿?ＮＨ＾??－〇ｏｃ’?ＯＯＣ?－〇〇ｃ?ＯＯＣ?ＯＯＣ??圖１＿２賴氨酸的二氨基庚二酸生物合成途徑【３９］??Ｆｉｇ．?１－２?Ｄｉａｍｉｎｏｐｉｍｅｌａｔｅ?ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ?ｐａｔｈｗａｙ?ｏｆ?ｌｙｓｉｎｅ??賴氨酸的二氨基庚二酸生物合成途徑在大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌中己經(jīng)得到了??廣泛研宄，被工程化用于工業(yè)化生產(chǎn)賴氨酸。與大腸桿菌中ＤＡＰ途徑不同的是，谷??氨酸棒狀桿菌中存在一個多功能酶一一內(nèi)消旋－二氨基庚二酸脫氫酶（由基因＾洲編??碼），可以發(fā)揮〇３？０、〇３？（：、〇３？￡和〇３？？四個酶的作用，將［－哌啶－２，６－二羧酸直??接還原為Ｄ，Ｌ－二氨基庚二酸酯??１．３．１．２?ａ－氨基己二酸途徑??賴氨酸的ａ－氨基己二酸合成途徑存在于類桉樹和高等真菌中［３９］，其中ａ－氨基己??二酸是合成賴氨酸的前體。對該途徑生化和遺傳背景的了解主要源于對釀酒酵母的研??宂結(jié)果［３８，４１，４２］，—些發(fā)現(xiàn)也源于對解脂耶氏酵母［４３］、芥菜神經(jīng)孢菌［４４］和念珠菌［４５］的研??究。??真菌中賴氨酸的生物合成需要八個步驟，涉及七個游離中間體。生成ａ－氨基己二??酸途徑的前半部分步驟發(fā)生在線粒體中

ＫＧ?ＣＯ＾?ＮＡＤＨ??卜ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ?ＭＡｎＰ＋?６?Ｌ－ｕ－ａｍｉｎｏａｄｉｐｉｃ?ａｃｉｄ?５?？ｘ－ｋｅｔｏａｄｉｐｉｃ?ａｃｉｄ?＂?４?ｈｏｍｏｉｓｏｃｉｔｒｉｃ?ａｃｉｄ??ｉ?－Ｇｌｕ．?ＮＡＤＰＨ??乂??Ｘ?ｖｉｉ??）＼?．??ＮＡＤＰ＇Ｈ２０?ｈ?ｎＨ２?Ｈ?，Ｃ０２Ｈ?ＮＡＤ?，?Ｈ２０?Ｈ?ＮＨ２??ＶＶ，＇?ｒ?Ｈ０２Ｃ＾＾＾ＮＨ？??Ｂ?Ｌ－ｓａｃｃｈａｒｏｐｉｎｅ?＾Ｃ〇＾Ｈ?ＮＡＤＨ＾ＫＧ?９?Ｌ－，ｙｓ，ｎｅ??圖１－３真菌中賴氨酸的（Ｉ－氨基己二酸合成途徑［３７］??Ｆｉｇ．?１－３?ａ－ａｍｉｎｏａｄｉｐａｔｅ?ｐａｔｈｗａｙ?ｆｏｒ?ｌｙｓｉｎｅ?ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ?ｉｎ?ｆｉｉｎｇｉ??１．３．２賴氨酸通過反向ｔ氨基己二酸途徑降解??自然界中賴氨酸的降解方式差異很大［３７］。如圖１－４所示，在真菌中，賴氨酸的ａ－??氨基己二酸合成途徑的最后兩個反應(yīng)是由酵母氨酸脫氫酶和賴氨酸－ａ－酮戊二酸還原??酶催化的［３８，４６］，而在植物和動物中，則通過該途徑的反向逆轉(zhuǎn)步驟導(dǎo)致賴氨酸降解??４９］??〇???—？?Ｌｙｓｉｎｅ?ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ?ｉｎ?ｐｌａｎｔｓ?ａｎｄ?ａｎｉｍａｌｓ??ａ－Ｋｅｉｏｇｌｕｉａｒａｉｃ?Ｇｉｕｉａｍａｌｅ??Ｔ＾？－ＣＨｌＣＨ２－Ｃ－Ｃ〇（ｒ??ｂ?ｉ?ｔ?ｓｒ?Ｊ?Ｈ?３?ｈ??ＨｊＮ－ＯｌｊＣ＾ｊＣＨａＣＨｊ－ｔｌ－ｔｉＯＣｒ?Ｈ－ｔ－Ｎ?０１，０１，－?Ｃ－ａＸＴ＾?Ｊ－ＣＷＩＭ?衛(wèi)ｚ＊?？?ＯＣ＾ａ＾ＭｊＯｉｒ?卜?ＸＸＴ??ＮＨｌ?３?＼?Ｗ?Ｚ?２ＮＢ＾?｜Ｔ?１?＼??Ｌｙｓｉ

【參考文獻】：
期刊論文
[1]異硫氰酸苯酯柱前衍生反相高效液相色譜法測定復(fù)序橐吾中21種氨基酸的含量[J]. 趙巖,彭蕾,陸珞,郜玉鋼,蔡恩博,張連學(xué).  中華中醫(yī)藥雜志. 2016(12)
[2]Red同源重組在大腸桿菌基因組修飾中的應(yīng)用[J]. 孫旭,周長林,方宏清.  生物技術(shù)通訊. 2011(06)
[3]微生物產(chǎn)賴氨酸的研究進展[J]. 劉曉飛,高學(xué)軍,劉營,敖金霞,王青竹.  東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報. 2010(01)
[4]Red同源重組技術(shù)研究進展[J]. 韓聰,張惟材,游松.  中國生物工程雜志. 2003(12)
[5]異硫氰酸苯酯柱前衍生化反相高效液相色譜法同時測定18種氨基酸[J]. 楊菁,孫黎光,白秀珍,周海濤.  色譜. 2002(04)

博士論文
[1]基于代謝工程選育谷氨酸棒桿菌L-賴氨酸高產(chǎn)菌[D]. 徐建中.江南大學(xué) 2014

碩士論文
[1]中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)及輔底物再生提高戊二酸產(chǎn)量[D]. 李文娜.北京化工大學(xué) 2018
[2]強化葡萄糖代謝途徑提高L-賴氨酸發(fā)酵水平的研究[D]. 劉冬冬.江南大學(xué) 2017
[3]大腸桿菌生物合成苯酚及酶法合成高谷氨酸[D]. 楊森.北京化工大學(xué) 2017
[4]基于代謝工程構(gòu)建大腸桿菌L-賴氨酸高產(chǎn)菌[D]. 趙德周.重慶大學(xué) 2017
[5]生產(chǎn)7-ACA廢液中α-氨基己二酸的提取工藝研究[D]. 于桂花.河北科技大學(xué) 2010



本文編號：3572462