【摘要】：5-氨基乙酰丙酸(ALA)是合成血紅素、(細(xì)菌)葉綠素及VB_(12)等物質(zhì)的重要前體,也已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)和醫(yī)療等領(lǐng)域。ALA生物合成途徑包括C4途徑和C5途徑。不產(chǎn)氧光合細(xì)菌(Anoxygenic phototrophic bacteria,APB)是一類依賴細(xì)菌葉綠素(BChl)進(jìn)行不產(chǎn)氧光合作用的代謝多樣性類群,ALA是BChl合成的必需前體,因此利用APB生產(chǎn)ALA也備受關(guān)注和青睞。但目前對C4和C5途徑在APB分布的認(rèn)識還不完善,也存在一定分歧,實驗證據(jù)缺乏。針對這些問題,本研究首先在基因組水平上,系統(tǒng)全面的分析了APB中C4和C5途徑的分布特點和規(guī)律;并選擇一株γ變形菌綱紫細(xì)菌Marichromatium gracile YL28對其ALA合成途徑進(jìn)行了實驗驗證;將源于APB C5途徑的ALA關(guān)鍵酶基因以及細(xì)菌葉綠素合成鎂螯合酶基因(bchHID)和鎂原卟啉甲基轉(zhuǎn)移酶基因(bchM)依次轉(zhuǎn)入E.coli BL21和Rhodopseudomonas palustris CGA009,探求了ALA的調(diào)控機制。主要研究結(jié)果如下:(1)ALA合成途徑基因組分析和驗證。收集了117株APB的基因組數(shù)據(jù),系統(tǒng)分析了ALA合成關(guān)鍵酶基因(gtr、gsa和hemA)在APB中的分布特征。首次發(fā)現(xiàn)了一個新的C4途徑的關(guān)鍵酶基因,提出了C4和C5途徑共存于綠細(xì)菌、β和γ變形菌綱的紫細(xì)菌的新認(rèn)識;以Marichromatium gracile YL28為研究對象,通過基因異源表達(dá)驗證了新型ALA合成酶基因的功能,證明了γ變形菌綱紫細(xì)菌YL28中除了含有C5途徑外,還存在C4途徑。(2)C5途徑基因?qū)LA合成的調(diào)控。將源于M.gracile YL28的C5途徑3個關(guān)鍵酶基因?qū)隕.coli BL21,獲得了4個重組菌,谷氨酸和葡萄糖的添加均上調(diào)ALA的積累量,gtr-gsa共表達(dá)菌株與其它3個單基因表達(dá)菌株相比,ALA積累量明顯升高。將源于YL28的C5途徑3個關(guān)鍵酶基因通過接合轉(zhuǎn)移的方法導(dǎo)入到含有C4途徑的R.palustris CGA009中,獲得了3個重組菌,結(jié)果表明外源C5途徑基因的表達(dá)均可提高重組菌的ALA積累量。(3)BChl合成途徑基因?qū)LA合成的調(diào)控。將源于YL28 BChl合成途徑的鎂螯合酶基因(bchHID)和鎂原卟啉甲基轉(zhuǎn)移酶基因(bchM)依次導(dǎo)入E.coli BL21中,獲得了2個重組菌,能合成APB所特有的細(xì)菌葉綠素中間體鎂原卟啉單甲酯,下調(diào)了ALA合成積累。綜上所述,本研究豐富了紫細(xì)菌和綠細(xì)菌中ALA合成途徑分布規(guī)律的認(rèn)識;首次提出綠細(xì)菌、β和γ變形菌綱紫細(xì)菌中共存C4和C5途徑的新認(rèn)識,發(fā)現(xiàn)了一個新的C4途徑的ALA合成關(guān)鍵基因,對ALA代謝調(diào)控進(jìn)行了初步研究,為進(jìn)一步深入研究ALA的代謝調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：華僑大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q933;TQ226.35
【圖文】：

BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線

ALA標(biāo)準(zhǔn)曲線

目的基因瓊脂糖凝膠電泳檢測

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2754387