【摘要】：柑橘酸腐病(Sour rot)是由白地霉(Geotrichum citri-aurantii)引起的一種常見且嚴(yán)重的柑橘采后侵染性病害。它在潮濕的貯藏環(huán)境下易發(fā)病,引起大量柑橘果實(shí)腐爛,從而造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。化學(xué)殺菌劑是控制柑橘采后病害的主要方式,但對(duì)柑橘酸腐病的控制效果較差。且隨著殺菌劑的長(zhǎng)期使用,又逐漸出現(xiàn)了耐藥性、高殘留、環(huán)境污染及安全等問題。因此,亟需尋找和開發(fā)更加安全綠色的化學(xué)試劑和其他替代物來(lái)控制柑橘采后病害�？咕�(AMPs)是一種具有廣譜抑菌活性的小分子多肽。已有研究報(bào)道,一些抗菌肽可以有效控制桃褐腐病、草莓灰霉病和蘋果青霉病等。由于抑菌活性強(qiáng),無(wú)環(huán)境污染,且不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn),抗菌肽具有作為新型的生物農(nóng)藥的優(yōu)勢(shì)及潛力,在控制采后病害方面具備良好的應(yīng)用前景。本文主要通過(guò)三種昆蟲來(lái)源的抗菌肽mastoparan-S,thanatin和ponericin W1對(duì)柑橘采后酸腐病病原菌(白地霉,G.citri-aurantii)的體內(nèi)和體外抑菌實(shí)驗(yàn),研究其對(duì)G.citri-aurantii的抑菌效果及對(duì)柑橘果實(shí)酸腐病的控制作用。同時(shí),通過(guò)掃描電鏡和熒光染色觀察、胞外電導(dǎo)率和胞內(nèi)核酸物質(zhì)泄漏測(cè)定、與基因組DNA體外結(jié)合的凝膠阻滯分析、紫外光譜及熒光光譜分析等實(shí)驗(yàn),研究了mastoparan-S,thanatin和ponericin W1對(duì)G.citri-aurantii細(xì)胞膜和DNA的影響。主要研究結(jié)果如下:(1)三種抗菌肽對(duì)G.citri-aurantii的體外抑菌作用抗菌肽mastoparan-S,thanatin和ponericin W1對(duì)G.citri-aurantii具有很強(qiáng)的生長(zhǎng)抑制作用和孢子致死作用,且這種作用效果隨著濃度增加而增強(qiáng)。抗菌肽mastoparan-S,thanatin和ponericin W1的最小抑菌濃度(MIC)分別為8μmol L~(-1),8μmol L~(-1),2μmol L~(-1),最小殺菌濃度(MFC)分別為8μmol L~(-1),8μmol L~(-1),4μmol L~(-1)。(2)三種抗菌肽對(duì)柑橘果實(shí)酸腐病的控制作用在抗菌肽與病原菌同孔接種的情況下,mastoparan-S,thanatin和ponericin W1對(duì)柑橘酸腐病害的發(fā)生均有較好的控制作用,且控制效果與處理方式和濃度有關(guān)�？咕娜芤号c病原菌液混合0 h(或2 h)后處理的抑制效果要好于抗菌肽單獨(dú)應(yīng)用在病原菌接種之前(或之后)。在混合0 h(2 h)接種的處理方式下,柑橘果實(shí)貯藏15 d后,mastoparan-S,thanatin和ponericin W1處理組酸腐病的發(fā)病率與對(duì)照組相比分別降低了16.67%(21.43%),28.57%(28.57%)和22.62%(22.62%)。當(dāng)抗菌肽在病原菌接種之后處理時(shí),mastoparan-S的抑菌效果隨濃度增加其提高,而thanatin和ponericin W1則在100μmol L~(-1)時(shí)就已達(dá)到其最好的抑制效果,其控制效果不再隨濃度變化。在抗菌肽與病原菌異孔接種的情況下,抗菌肽mastoparan-S,thanatin和ponericin W1均對(duì)柑橘果實(shí)酸腐病的發(fā)生沒有控制效果,說(shuō)明抗菌肽處理不會(huì)誘導(dǎo)柑橘果實(shí)產(chǎn)生抗病性。(3)三種抗菌肽對(duì)G.citri-aurantii細(xì)胞膜的影響通過(guò)掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn),抗菌肽mastoparan-S,thanatin,ponericin W1作用后均可引起菌絲和孢子表面形態(tài)不同程度的變化。具體表現(xiàn)為:菌絲塌陷扭曲折疊,孢子表面出現(xiàn)凹陷,其中,ponericin W1的作用效果最強(qiáng)。通過(guò)檢測(cè)胞外電導(dǎo)率和胞內(nèi)核酸物質(zhì)泄漏,結(jié)合熒光染色可得出,抗菌肽能與G.citri-aurantii細(xì)胞膜作用,增加細(xì)胞膜通透性使其完整性受損,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外泄。其中,ponericin W1的膜破壞能力最強(qiáng),mastoparan-S和thanatin只有在高濃度下才能對(duì)細(xì)胞膜完整性有一定程度的破壞。此外,通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察抗菌肽的定位發(fā)現(xiàn),mastoparan-S,thanatin和ponericin W1還可以穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi),說(shuō)明也存在胞內(nèi)作用機(jī)制。(4)三種抗菌肽對(duì)G.citri-aurantii基因組DNA的影響通過(guò)凝膠阻滯試驗(yàn)、紫外光譜和熒光光譜分析可知,抗菌肽mastoparan-S,thanatin和ponericin W1與G.citri-aurantii基因組DNA首先通過(guò)靜電引力相結(jié)合,進(jìn)一步可以與DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的溝槽結(jié)合,破壞或改變DNA的空間結(jié)構(gòu),以部分嵌插或嵌插的方式結(jié)合到DNA的堿基對(duì)之間,與DNA發(fā)生相互作用。其中,mastoparan-S引起DNA斷裂的能力最弱。此外,抗菌肽mastoparan-S,thanatin,ponericin W1的處理還能夠在一定程度上抑制G.citri-aurantii的DNA和RNA的合成。綜上所述,本文所研究的抗菌肽mastoparan-S,thanatin和ponericin W1對(duì)G.citri-aurantii具有較強(qiáng)的抑制作用,同時(shí)也能有效地控制柑橘果實(shí)酸腐病的發(fā)生。這三種抗菌肽均能引起G.citri-aurantii細(xì)胞膜完整性的改變,且能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與遺傳物質(zhì)發(fā)生作用,從而引起細(xì)胞死亡。本研究旨在為控制柑橘采后酸腐病病害提供新的思路和和理論參考。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：TQ455.4;TS255.3
【圖文】：

第一章 文獻(xiàn)綜述型”之間一種模型。抗菌肽吸附在細(xì)胞膜表面，形成 α-螺旋結(jié)構(gòu)垂直插入導(dǎo)致脂單層連續(xù)彎曲形成環(huán)孔�？咕姆肿优c磷脂親水性頭部基團(tuán)作用內(nèi)側(cè)，這也是與桶板模型的差別。研究認(rèn)為，以細(xì)胞質(zhì)組分為靶點(diǎn)的抗菌通過(guò)這種機(jī)制進(jìn)入細(xì)胞膜的，當(dāng)環(huán)孔瓦解時(shí)會(huì)導(dǎo)致肽分子被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞膜magainin 2，aurein 3.3 和 arenicin 等都是通過(guò)這種方式起作用的[66]-[68]。

第一章 文獻(xiàn)綜述膜的透性增加并不一定會(huì)直接導(dǎo)致細(xì)胞死亡，研究表明某些抗互作用只是其作用方式的第一步，而胞內(nèi)的 DNA（或 RNA）則點(diǎn)。Park 等人[86]研究發(fā)現(xiàn)，Buforin Ⅱ可以在不擾亂膜結(jié)構(gòu)的情胞膜，與胞內(nèi) DNA 和 RNA 結(jié)合且不從而造成細(xì)菌死亡，隨后了 Buforin 衍生肽具有 DNA 體外結(jié)合能力。Lan 等人[87]通過(guò)圓研究了 Buforin Ⅱ與磷脂膜和 DNA 結(jié)合時(shí)構(gòu)象的變化，發(fā)現(xiàn)雖膜相互作用時(shí)具有螺旋結(jié)構(gòu)，但在與 DNA 結(jié)合時(shí)采取伸展鏈的 DNA 結(jié)合活性不需要 α-螺旋結(jié)構(gòu)。Tang 等人[88]發(fā)現(xiàn)一種家具有雙重殺菌機(jī)制，不僅可以破壞細(xì)菌細(xì)胞膜還與細(xì)菌基因組胞功能，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。Yonezawa 等人[89]通過(guò)凝膠阻滯試發(fā)現(xiàn)，tachyplesin I 可以在體外與雙鏈 DNA 小溝結(jié)合。此外，不僅具有干擾膜的能力，還能夠抑制 DNA 合成，與鈣調(diào)蛋白結(jié)

圖 2-1 抗菌肽對(duì) G. citri-aurantii 生長(zhǎng)抑制劑量曲線ponse curves of growth inhibition of G. citri-aurantii b

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