【摘要】：熊去氧膽酸(英文名:Ursodesoxycholic acid,UDCA),是傳統(tǒng)的中藥的有效成分,有著非常廣泛的臨床應(yīng)用和卓越的藥用價(jià)值,在治療膽結(jié)石,促進(jìn)肝移植,膽汁反流性胃炎,酒精肝,膽汁性肝硬化,和藥物誘發(fā)的肝炎,有非常好的療效,市場(chǎng)用量很大。目前,制備UDCA主要有活熊取膽汁和人工合成兩種方法,天然來(lái)源是活熊取膽或熊膽汁,活熊受到動(dòng)物保護(hù)法的保護(hù),提取來(lái)源受到限制造成天然熊膽的來(lái)源日趨減少。人工合成是指使用能夠大量獲取的牛、鵝膽汁提取的鵝去氧膽酸(Chenodeoxycholic acid,CDCA)化學(xué)法合成UDCA,通過(guò)氧化還原的方法使7-OH發(fā)生構(gòu)型反轉(zhuǎn),但是存在著反應(yīng)過(guò)程復(fù)雜、低選擇性、反應(yīng)條件苛刻、能耗大、污染大等一系列問(wèn)題,尤其是保護(hù)和脫保護(hù)過(guò)程中需要有毒和危險(xiǎn)試劑,嚴(yán)重限制了化學(xué)法的工業(yè)化應(yīng)用。目前使用化學(xué)法生產(chǎn)的UDCA約占到市場(chǎng)份額的30%,而且制備高純度較低,約80%左右,還遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)對(duì)UDCA的用量及質(zhì)量的需求。與化學(xué)差向異構(gòu)化相比,CDCA生物合成UDCA具有高效性和相對(duì)環(huán)境友好性。微生物轉(zhuǎn)化或生物酶催化主要圍繞7α-羥基類(lèi)固醇脫氫酶(7α-HSDH)和7β-羥基類(lèi)固醇脫氫酶(7β-HSDH)展開(kāi),利用產(chǎn)7α-HSDH和7β-HSDH的泥渣梭菌、不和諧梭菌、巴氏梭菌和嗜麥芽黃單胞菌,實(shí)現(xiàn)了CDCA向UDCA的生物轉(zhuǎn)化。然而,高濃度的CDCA抑制細(xì)胞生物量的積累,在產(chǎn)品回收和純化過(guò)程中存在困難。此外,以往的研究表明,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),中間體的產(chǎn)量增加,UDCA降低,無(wú)法實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。近年來(lái),聯(lián)合應(yīng)用7α-HSDH和7β-HSDH將CDCA為底物兩步法生成UDCA,成為研究熱點(diǎn),目前已經(jīng)有研究的綜合轉(zhuǎn)化率能超過(guò)90%,但反應(yīng)量?jī)H為毫升級(jí)別,距離工業(yè)化生產(chǎn)還有很大距離。主要的限制性瓶頸為:1)以CDCA為底物兩步法中的關(guān)鍵酶7β-HSDH極度不穩(wěn)定,盡管酶活夠高,但在催化反應(yīng)體系中會(huì)快速失活;2)兩步法的反應(yīng)體系能夠承載的底物量太低(體積比1%),體系不穩(wěn)定;3)兩步法的兩種關(guān)鍵酶工業(yè)級(jí)應(yīng)用的大規(guī)模來(lái)源問(wèn)題;4)酶蛋白分離純化的成本過(guò)高。本論文針對(duì)7β-HSDH極度不穩(wěn)定,底物濃度太低和無(wú)法實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的主要限制性瓶頸,在成功構(gòu)建和異源表達(dá)7α-HSDH和7β-HSDH的基礎(chǔ)上,主要從基因工程酶的構(gòu)建過(guò)程和酶催化體系的構(gòu)建來(lái)提高7β-HSDH酶催化性能方面著手,提高體系中酶的穩(wěn)定性,提高底物承載能力,使其適應(yīng)酶催化的工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程;通過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)工藝優(yōu)化,探索大規(guī)模發(fā)酵工藝,酶催化過(guò)程工業(yè)酶的來(lái)源問(wèn)題;最后,公斤級(jí)工業(yè)化生產(chǎn)和純化工藝的研究。基因工程酶7β-HSDH的構(gòu)建過(guò)程中標(biāo)簽對(duì)實(shí)際催化過(guò)程有著很大的影響,盡管帶有6His標(biāo)簽的重組酶7β-HSDH有更高的酶活,但是帶有GST標(biāo)簽的重組酶7β-HSDH有更高的熱穩(wěn)定性,更適合實(shí)際工業(yè)催化過(guò)程。經(jīng)過(guò)測(cè)酶活和實(shí)際催化對(duì)比發(fā)現(xiàn),用熱穩(wěn)定性模擬、考察6His和GST兩種不同標(biāo)簽的7β-HSDH重組酶在40°C下的失活曲線特性,驗(yàn)證了GST標(biāo)簽的7β-HSDH重組酶較6His標(biāo)簽的重組酶的熱穩(wěn)定性增加12倍。同時(shí),酶催化體系的構(gòu)建過(guò)程中,在體系中添加該復(fù)合穩(wěn)定劑(0.15%EDTA+0.5%氯化鈉+0.2%明膠),可以很大程度地提高體系中酶的穩(wěn)定性,酶活殘留率為97.8%,提高底物承載能力,使重組酶可以持續(xù)進(jìn)行催化反應(yīng)。對(duì)兩種重組菌培養(yǎng)及誘導(dǎo)條件進(jìn)行了優(yōu)化摸索,并實(shí)現(xiàn)50L發(fā)酵罐的高密度發(fā)酵,重組菌的OD值達(dá)到100,7α-HSDH和7β-HSDH酶生物活性分別為13.6 U/mL和7.6 U/mL,解決了兩種關(guān)鍵酶的大規(guī)模來(lái)源問(wèn)題。最后,構(gòu)建了一套高效的UDCA酶催化生產(chǎn)工藝,表達(dá)兩種關(guān)鍵酶的重組菌進(jìn)行高密度發(fā)酵后,發(fā)酵液經(jīng)過(guò)破碎和初步過(guò)濾,得到的粗酶液即可投入催化反應(yīng)體系進(jìn)行催化,降低了酶蛋白純化成本,提高了底物承載量,實(shí)現(xiàn)了在最高50L的催化反應(yīng)體系中進(jìn)行反應(yīng),底物承載量達(dá)到50g/L,催化反應(yīng)的得率和效率達(dá)到工業(yè)化應(yīng)用的要求,最終成功應(yīng)用于由CDCA到UDCA的公斤級(jí)工業(yè)化生產(chǎn),成品收率大于90%。
【學(xué)位授予單位】：西北大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：TQ461;TQ920.1
【圖文】：

圖 1 熊去氧膽酸結(jié)構(gòu)式中含一個(gè)羧基和兩個(gè)醇羥基，因此能夠參與反應(yīng)。去氧膽酸分子中的羧基可以和各類(lèi)醇發(fā)生酯，例如濃硫酸、濃鹽酸、發(fā)煙硫酸、HCl 氣用量也有所差異。例如：如果催化劑用的是如果用的是濃鹽酸，那么反應(yīng)的配料比一般10:0.1。此類(lèi)酯化反應(yīng)大多采用溶劑回流的溫度約 15 分鐘，酯的收率可以達(dá)到 80-90%甚至用，則可以在較低的溫度下進(jìn)行反應(yīng)。例如35℃的條件下制備熊去氧膽酸與各類(lèi)醇反應(yīng)%。

圖 2 熊去氧膽酸的酯化反應(yīng)（2）�；磻�(yīng)：熊去氧膽酸分子中的羥基可以和酸酐、酰氯等酰化試劑化反應(yīng)，如圖 3，因?yàn)轷；螽a(chǎn)物比較容易結(jié)晶提純，所以這個(gè)反應(yīng)常用來(lái)保氧膽酸的羥基或純化熊去氧膽酸。例如：熊去氧膽酸甲酯在醋酸酐-吡啶的反中回流 2 小時(shí)，可以生成二乙酰基衍生物；在醋酸酐-苯的反應(yīng)體系中回流，到 C3 位羥基被�；�、C7 位羥基不被酰化的�；苌�，反應(yīng)的方程式如示。這說(shuō)明熊去氧膽酸上 C3 位羥基的活潑性大于 C7 位羥基。而被�；蟮哪懰峒柞�，在 NaOH 的甲醇溶液中回流約 15 小時(shí)，即可完全水解。

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本文編號(hào)：2753379