【摘要】：支鏈氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸)是植物生長(zhǎng)的必需氨基酸。這些氨基酸的生物合成途徑由三種酶組成:乙酰乳酸合酶(ALS)、乙酰羥酸異構(gòu)酶(KARI)和二羥酸脫水酶(DHAD)。二羥酸脫水酶DHAD在支鏈氨基酸BCAA生物合成途徑中催化α,β-二羥酸脫水,形成亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸的前體α-酮酸。DHAD蛋白參與了植物必需氨基酸的合成,因此在不同的植物物種中高度保守。而這一途徑在哺乳動(dòng)物中并不存在,所以可以作為良好的除草劑作用靶點(diǎn)。加州大學(xué)洛杉磯分校唐奕教授課題組使用以抗性基因?yàn)閷?dǎo)向的基因組挖掘技術(shù),發(fā)現(xiàn)了天然產(chǎn)物aspterric acid(AA)可以靶向作用于二羥酸脫水酶(DHAD),從而起到抑制植物生長(zhǎng)的作用。他們還發(fā)現(xiàn):產(chǎn)生菌自身除了含有DHAD外,還有一個(gè)與DHAD有70%同源性的蛋白Ast D,并證明Ast D對(duì)于AA具有抗性。本文的工作是通過X-ray單晶衍射方法解析了含有二鐵二硫簇的DHAD全酶的結(jié)構(gòu),通過與袁曙光博士合作,通過計(jì)算化學(xué)的方法模擬AA抑制DHAD的機(jī)制。解釋了Ast D對(duì)AA產(chǎn)生抗性的原因,本工作主要通過以下四步完成:1.通過鐵硫簇重構(gòu),獲得鐵硫簇含量0.8以上的有活性中心的蛋白質(zhì)。2.通過多步柱層析、無(wú)氧重構(gòu)、無(wú)氧純化等方法獲得高純度含二鐵二硫簇的DHAD母體蛋白。3.通過坐滴式氣相擴(kuò)散的方法篩選獲得1.8?左右分辨率的蛋白質(zhì)晶體衍射數(shù)據(jù),并通過使用PDB ID為5j83的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)作為模板用分子置換的方法解析了蛋白質(zhì)母體結(jié)構(gòu)。4.為了探究蛋白質(zhì)與抑制劑分子的結(jié)合狀態(tài),通過分子對(duì)接和結(jié)構(gòu)模擬的方法探究了AA抑制DHAD的方式,以及Ast D產(chǎn)生抗性的機(jī)制。本論文工作首次解析了含有二鐵二硫簇的DHAD全酶的晶體結(jié)構(gòu)。通過與袁曙光博士合作,進(jìn)行了分子對(duì)接和結(jié)構(gòu)模擬,發(fā)現(xiàn)AA阻擋在通道當(dāng)中,從而阻止了天然底物的進(jìn)入,通過模擬Ast D的結(jié)構(gòu),闡明Ast D具有抗性是因?yàn)橥ㄏ蚧钚灾行牡耐ǖ垒^窄,不允許AA分子通過。我們的研究為靶向DHAD的新型除草劑研發(fā)奠定了重要基礎(chǔ)。我們希望進(jìn)一步通過對(duì)DHAD的改造,使農(nóng)作物中的DHAD具有AA抗性,從而使AA及其類似物的使用得到可能。
【學(xué)位授予單位】：上海師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：TQ457
【圖文】：

抗性雜草種類和數(shù)量發(fā)展趨勢(shì)(Heap,2019)

新型天然產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)模式以生物信息學(xué)為指導(dǎo)，通過基因組挖掘的方新型天然產(chǎn)物。該方法不僅可以排除已知的化合物的干擾，節(jié)約人力它還能挖掘微生物體內(nèi)一些沉默基因簇，大大地拓寬了天然產(chǎn)物的挖掘如何從海量的微生物基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中挖掘新型活性化合物的生物合成仍然是研究人員關(guān)注且亟待解決的挑戰(zhàn)。近年來(lái)，研究人員提出了通過抗性基因的介導(dǎo)從微生物基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中活性化合物的方法[15]。如圖 1-3，研究表明：微生物對(duì)天然產(chǎn)物產(chǎn)生抗廣泛存在的現(xiàn)象，在活性天然產(chǎn)物的選擇壓力下，微生物不得不通過不到抗性基因，來(lái)保護(hù)自己免受天然產(chǎn)物的傷害，而且這些抗性基因通常活性天然產(chǎn)物生物合成基因簇內(nèi)或者附近。目前，一些研究人員已經(jīng)依因挖掘出了一些微生物產(chǎn)生的新型活性天然產(chǎn)物，比如 BradyMoore 和者使用這種基于抗性基因的天然產(chǎn)物挖掘方法成功找到了一種 PKS酶的新型抑制劑[16]；Oakley 和他的合作者使用該方法成功找到了一種酶抑制劑 Fellutamide B[17]。

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本文編號(hào)：2730290