【摘要】：麥芽寡糖基海藻糖水解酶(maltooligosyl trehalose trehalohydrolase,MTHase,EC3.2.1.141)能特異性識(shí)別底物麥芽寡糖基海藻糖的海藻糖部分,并通過(guò)水解作用生成海藻糖。產(chǎn)物海藻糖由于具有保濕、防曬和低甜度等特點(diǎn),被應(yīng)用于生物醫(yī)藥、食品和日化等行業(yè)。來(lái)源于嗜酸熱硫礦硫化葉菌(Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909)的MTHase具有制備海藻糖的優(yōu)良性能,但在其重組制備過(guò)程中容易形成較多包涵體,影響可溶性表達(dá),導(dǎo)致使用成本高。本研究對(duì)S.acidocaldarius MTHase進(jìn)行改造:基于多重序列比對(duì),選取21個(gè)疏水氨基酸進(jìn)行替換以提高M(jìn)THase的可溶性表達(dá)。以獲得的突變體L202P/L218D/Y323G的質(zhì)粒為模板,通過(guò)隨機(jī)突變,篩選獲得有效突變體。對(duì)有效突變體進(jìn)行飽和突變和疊加突變,得到最佳突變體。在最佳突變體搖瓶發(fā)酵的基礎(chǔ)上進(jìn)行3 L罐發(fā)酵優(yōu)化。主要研究結(jié)論如下:(1)對(duì)S.acidocaldarius MTHase進(jìn)行多重序列比對(duì),選擇非保守區(qū)域的位于蛋白表面的21個(gè)疏水氨基酸,替換為相同位點(diǎn)上的其他來(lái)源的親水氨基酸(除了202位點(diǎn):其他來(lái)源的此位點(diǎn)是疏水氨基酸),研究蛋白可溶性表達(dá)。突變體Y21Q、L77E、L202P、L218D和Y323G酶活分別提高1.2、1.4、1.3、1.3和1.4倍,通過(guò)疊加突變,其中突變體L202P/L218D/Y323G酶活最高,達(dá)到59.4 U·mL~(-1),該突變體酶活提高1.9倍。(2)對(duì)突變體L202P/L218D/Y323G進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究。結(jié)果顯示,與野生型酶比較,氨基酸的替換對(duì)MTHase酶學(xué)性質(zhì)的影響甚微。該突變體酶活提高是因?yàn)榈鞍妆磉_(dá)量的提高。(3)以突變體L202P/L218D/Y323G的質(zhì)粒為模板,通過(guò)隨機(jī)突變構(gòu)建突變文庫(kù)并結(jié)合高通量快速篩選,最終獲得兩株酶活提高的突變體。突變體抽提質(zhì)粒,進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)突變位點(diǎn),對(duì)有效突變體進(jìn)行飽和突變和疊加突變,最終獲得的最佳突變體M140L/L202P/L218D/Y323G/F338S/I404T(簡(jiǎn)稱突變體MTHase~m)酶活比野生型高2.4倍。(4)對(duì)最佳突變體進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究,結(jié)果顯示突變體的酶學(xué)性質(zhì)與野生型相似。將突變體與實(shí)驗(yàn)室保存的相同來(lái)源的麥芽寡糖基海藻糖合成酶(maltooligosyl trehalose synthase,MTSase,EC5.4.99.15)共同作用麥芽糊精(DE值5-7)生產(chǎn)海藻糖,結(jié)果顯示海藻糖轉(zhuǎn)化率未受到較大影響。(5)對(duì)突變體MTHase~m進(jìn)行3 L罐發(fā)酵優(yōu)化,最佳發(fā)酵條件為:發(fā)酵前期37℃恒溫培養(yǎng),當(dāng)OD_(600)達(dá)到50時(shí),溫度降低至30℃,恒速流加乳糖(流速為0.1 g·L~(-1)·h~(-1))進(jìn)行誘導(dǎo)。誘導(dǎo)27 h,該突變體的酶活最高達(dá)到444.8 U·mL~(-1),約為搖瓶發(fā)酵酶活的5.9倍。
【圖文】：

圖 1-1 麥芽寡糖基海藻糖水解酶的空間結(jié)構(gòu) 1-1 Spatial structure of maltooligosyl trehalose trehalohydr表 1.1 來(lái)源不同的 MTHase 酶學(xué)性質(zhì)Table 1.1 Different properities of MTHase from different bacteriu

化機(jī)制及底物專一性水解活性，主要以麥芽寡糖基海藻糖作為底物THase 為例，麥芽寡糖基海藻糖從 N 端結(jié)構(gòu)域的表 之間的缺口移動(dòng)，隨后到達(dá)(β/α)8桶的 C 末端。308378 位的谷氨酰胺與底物還原端形成的氫鍵和 Trp215對(duì)底物海藻糖部分高效識(shí)別，并切割鄰近α-1, 1-糖苷(如圖 1-2 所示)。該催化反應(yīng)認(rèn)為是通過(guò)一般酸/堿催似[27]。序列和結(jié)構(gòu)比較表明，，Sulfolobus solfataricus , 4-糖苷鍵中-1 亞位點(diǎn)的 C1，E283 作為質(zhì)子供體，底物，對(duì)-1 亞位點(diǎn)的葡萄糖作用形成較多的氫鍵[17]芽寡糖基海藻糖作用于α-1, 1-糖苷鍵，也催化麥芽釋放葡萄糖，其活性約為水解麥芽寡糖基海藻糖釋放
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：TQ920.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2702264