【摘要】：我國(guó)在2010年批準(zhǔn)了DHA藻油為新資源食品,包括以裂壺藻(Schizochytrium sp.)、寇氏隱甲藻(Crypthecodiniumcohnii)和吾肯氏壺藻(Ulkeniaameoboida)為來源的海洋微藻。本文以裂壺藻突變株(Schizochytrium limacinum mutant strain)為原始菌株,首先觀察培養(yǎng)過程中裂壺藻的細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育和油脂積累過程,描述其形態(tài)學(xué)特征;然后通過添加外源化學(xué)劑研究裂壺藻突變株發(fā)酵合成脂肪酸(SFAs、PUFAs和DHA)的影響,采用基于氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用技術(shù)分析脂肪酸的組成及含量。最后對(duì)裂壺藻突變株的酶法破壁工藝進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化,提高了油脂產(chǎn)量和DHA產(chǎn)量,并在最佳酶解條件下對(duì)裂壺藻突變株進(jìn)行50 L發(fā)酵罐放大生產(chǎn)。二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid)是一種多不飽和脂肪酸,簡(jiǎn)稱DHA。這種多不飽和脂肪酸對(duì)人體的大腦發(fā)育具有積極的促進(jìn)作用,特別對(duì)嬰幼兒的健康成長(zhǎng)起到關(guān)鍵作用。然而,我們?nèi)梭w自身難以合成這種脂肪酸,需要通過外界攝取才能獲得。DHA傳統(tǒng)上來源于深海魚油,不但魚油DHA是魚類食用了含有DHA的藻類和浮游生物而累積的,而且由于海洋污染等諸多因素導(dǎo)致市場(chǎng)供應(yīng)不足,無法滿足人們的需求,利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)DHA成為主要的研究方向。主要研究成果如下:1.觀察分析裂壺藻突變株的形態(tài)特征和油脂積累通過對(duì)裂壺藻突變株生長(zhǎng)發(fā)育過程中形態(tài)的研究,直觀地對(duì)其藻落形態(tài)、顯微形態(tài)和電鏡形態(tài)進(jìn)行了描述�？梢园l(fā)現(xiàn),隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),藻體細(xì)胞進(jìn)行分裂增殖,不斷地裂殖生長(zhǎng),細(xì)胞數(shù)目逐漸增加、體積變大,生命代謝旺盛并且胞內(nèi)有油脂的積累。微藻細(xì)胞開始分裂生殖,進(jìn)入對(duì)數(shù)期生長(zhǎng),細(xì)胞數(shù)量大量增加,培養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被逐漸消耗,同時(shí)培養(yǎng)液由于微藻的生長(zhǎng)變得濃稠,培養(yǎng)液顏色變深。培養(yǎng)約120h后,胞內(nèi)油脂越來越多,逐漸連接成片狀,此時(shí)微藻細(xì)胞的生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期,產(chǎn)生大量油脂。2.化學(xué)添加劑對(duì)裂壺藻突變株發(fā)酵產(chǎn)DHA的影響考察外源化學(xué)添加劑對(duì)裂壺藻突變株發(fā)酵合成脂肪酸(SFAs、PUFAs和DHA)的影響。首先通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)裂壺藻突變株在發(fā)酵期添加適量濃度的乙醇胺(ETA)、萘氧乙酸(BNOA)和水楊酸(SA)會(huì)提高裂壺藻突變株的DHA含量。經(jīng)氣質(zhì)分析(GC-MS)可以發(fā)現(xiàn),相對(duì)于對(duì)照組來說,飽和脂肪酸量有所下降而不飽和脂肪酸量有所提高。通過單因素實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵期添加適量的三種化學(xué)添加劑均可以提高藻株合成DHA的能力,分別添加150mg/L的乙醇胺(ETA),10mg/L的萘氧乙酸(BNOA)和0.5mg/L的水楊酸(SA),結(jié)果顯示DHA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)相比于對(duì)照組分別提高了16.81%,15.52%,17.94%。然后通過正交實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)同時(shí)添加150mg/L的乙醇胺(ETA)、10mg/L萘氧乙酸(BNOA)和1mg/L水楊酸(SA)能夠提高裂壺藻突變株合成DHA的能力,DHA的產(chǎn)量達(dá)到了6.18g/L,比對(duì)照組提高了12.77%。3.響應(yīng)面法優(yōu)化裂壺藻突變株的酶法破壁條件為了探索藻油提取過程中細(xì)胞破壁技術(shù)的最佳工藝條件,采用堿性蛋白酶對(duì)裂壺藻突變株進(jìn)行破壁,提取胞內(nèi)油脂,并研究了酶解溫度、酶解時(shí)間、酶用量、pH值對(duì)油脂產(chǎn)量和DHA產(chǎn)量的影響。然后在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),篩選出最佳的破壁條件,利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC_MS)分析了最佳條件下藻油的脂肪酸組成及含量。結(jié)果表明,在酶解溫度55℃,酶解時(shí)間9h,酶用量為生物量的3%,pH 8條件下進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng),油脂產(chǎn)量和DHA產(chǎn)量達(dá)到最高,分別為14.52 g/L和7.12 g/L。同時(shí)進(jìn)行了50 L發(fā)酵罐放大實(shí)驗(yàn),油脂產(chǎn)量和DHA產(chǎn)量分別達(dá)到了26.27 g/L和12.89 g/L。
【圖文】：

武漢輕工大學(xué)碩士學(xué)位論文]。PUFAs 按照第一個(gè)雙鍵在甲基位置上的不同分為ω-3、ω-6 和，其中具有重要生理學(xué)功能的是ω-3 和ω-6 系脂肪酸。ω-3 系脂肪麻酸（ALA）轉(zhuǎn)化而來，主要包括二十碳五烯酸（EPA）、二十二HA），ω-6 系脂肪酸則是由亞油酸轉(zhuǎn)化而來的，主要包括亞油酸（（GLA）和花生四烯酸（AA）[25]。PUFAs 是細(xì)胞膜細(xì)胞膜的重要人體健康非常重要，尤其是對(duì)新生兒的大腦和視力的發(fā)育是必要 的系統(tǒng)命名為順-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸，化學(xué)分子。含有 22 個(gè)碳原子，，6 個(gè)不飽和雙鍵，屬于ω-3 系多不飽和脂肪酸。構(gòu)式如圖 1.1 所示[26]。

廣東潤(rùn)科生物科技有限公司和嘉必優(yōu)生物科技有限公司等企業(yè)利用裂壺藻進(jìn)行了DHA的工業(yè)化生產(chǎn)。裂壺藻在自然界中分布廣泛，藻體形態(tài)如圖1.2所示。裂壺藻細(xì)胞代謝可以積累大量的活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)對(duì)人體健康有益，包括多不飽和脂肪酸和角鯊烯等，細(xì)胞中90%以上的油脂以甘油三酯形式存在，容易被人體吸收。裂壺藻是目前工業(yè)化生產(chǎn)DHA比較理想的菌種，應(yīng)用價(jià)值高，前景廣闊。A B C圖 1.2 裂壺藻的藻落形態(tài)（A）、顯微形態(tài)（B）和電鏡形態(tài)（C）Fig 1.2 Colony,micro-morphology and electron microscope morphology of Schizochytrium sp.
【學(xué)位授予單位】：武漢輕工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：TQ921

【參考文獻(xiàn)】

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1 袁軍;趙r

本文編號(hào)：2700121