【摘要】：γ-氨基丁酸是哺乳動(dòng)物體內(nèi)主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì),具有多種重要的生理功能,如安神、降血壓和利尿等,可作為生物活性因子應(yīng)用于食品與醫(yī)藥行業(yè)。乳酸菌通常被認(rèn)為是安全的微生物,與人和動(dòng)物的生命活動(dòng)息息相關(guān),在食品與醫(yī)藥領(lǐng)域占有重要地位。乳酸菌合成γ-氨基丁酸具有安全和高效的優(yōu)點(diǎn),已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)室前期從健康成年男性腸道中分離出一株高產(chǎn)γ-氨基丁酸(252 g/L)的短乳桿菌CD0817,系目前已報(bào)道γ-氨基丁酸合成能力最強(qiáng)的乳酸菌,現(xiàn)保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏編號(hào)為CCTCC NO:M2018462。本論文就高產(chǎn)γ-氨基丁酸短乳桿菌CD0817全基因組序列測(cè)定及其比較基因組學(xué)、GABA合成系統(tǒng)(谷氨酸脫羧酶系統(tǒng))分析,以及新型基因組步移方法的建立進(jìn)行了研究,主要結(jié)果如下。(1)采用第二代高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)短乳桿菌CD0817的全基因組序列進(jìn)行了測(cè)定,繪制了其完成圖(染色體序列組裝至0 gap)。短乳桿菌CD0817基因組由1條環(huán)狀染色體和4個(gè)質(zhì)粒組成,總長(zhǎng)度為3,096,874 bp,平均GC含量為50.35%,其GenBank訪問(wèn)號(hào)為:CP032931.1(染色體chromosome);CP032932.1(質(zhì)粒pCD0817-1);CP032933.1(質(zhì)粒pCD0817-2);CP032934.1(質(zhì)粒pCD0817-3);CP032935.1(質(zhì)粒pCD0817-4)。短乳桿菌CD0817基因組中含有2,990個(gè)蛋白編碼基因、51個(gè)tRNA基因、16個(gè)rRNA基因(4個(gè)16S-23S-5S rRNA操縱子和1個(gè)16S-23S-5S-5S rRNA操縱子)以及3個(gè)sRNA;116個(gè)長(zhǎng)末端重復(fù)序列、68個(gè)DNA轉(zhuǎn)座子、23個(gè)長(zhǎng)散在重復(fù)序列以及7個(gè)短散在重復(fù)序列;106個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列、80個(gè)小衛(wèi)星DNA以及1個(gè)微衛(wèi)星DNA;8個(gè)基因島、2個(gè)前噬菌體、6個(gè)可信的CRISPR位點(diǎn)以及1個(gè)細(xì)菌素合成基因簇。短乳桿菌CD0817基因組上的2,990個(gè)蛋白編碼基因中,分別有1,290、1,556、1,407、2,563、1,030、2,459和79個(gè)蛋白編碼基因在COG、GO、KEGG、NR、Swiss-Prot、TrEMBL和CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)上得到注釋。(2)以15株已完成全基因組測(cè)序的短乳桿菌作為參考菌株,通過(guò)泛基因組分析、基因家族分析、共線性分析以及系統(tǒng)進(jìn)化分析等手段,對(duì)短乳桿菌CD0817進(jìn)行了比較基因組學(xué)研究。短乳桿菌CD0817具有很高的菌株特異性,在基因組結(jié)構(gòu)、組成和功能上均與其它短乳桿菌菌株之間存在顯著的差異。短乳桿菌CD0817可能與其它短乳桿菌菌株來(lái)源于共同的祖先,但在進(jìn)化早期與其它短乳桿菌菌株發(fā)生了分歧,獨(dú)自形成了一個(gè)不同的分枝。在選擇性壓力的驅(qū)動(dòng)下,短乳桿菌CD0817與其它短乳桿菌菌株之間的親緣關(guān)系逐漸變遠(yuǎn),從而形成了其現(xiàn)在獨(dú)有的基因組特征,成為一株特異性較高的短乳桿菌。(3)以短乳桿菌CD0817的谷氨酸脫羧酶系統(tǒng)為對(duì)象,詳細(xì)分析了該系統(tǒng)的基因構(gòu)成和序列特征,并與其它種類乳桿菌的谷氨酸脫羧酶系統(tǒng)進(jìn)行了比較分析。短乳桿菌CD0817基因組中只含有一個(gè)谷氨酸脫羧酶蛋白編碼基因gadA,并與其上游相鄰的谷氨酸/γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因gadC形成操縱子結(jié)構(gòu)(gadCA)。然而其它短乳桿菌基因組在gadCA操縱子下游約1.7 Mb處往往還存在一個(gè)單獨(dú)的谷氨酸脫羧酶蛋白編碼基因gadB。此外,短乳桿菌CD0817的谷氨酸脫羧酶蛋白編碼基因gadA明顯不同于其它短乳桿菌菌株,它們的DNA和氨基酸序列之間分別只表現(xiàn)出79%和91%的一致性。其它種類乳桿菌基因組中則通常只含有一個(gè)谷氨酸脫羧酶蛋白編碼基因,并且在親緣關(guān)系上與gadA或gadB相接近。短乳桿菌CD0817的谷氨酸脫羧酶GadA蛋白由481個(gè)氨基酸組成,共含有7,497個(gè)原子,分子式為C_(2409)H_(3708)N_(628)O_(730)S_(22),理論分子量為53.85kDa,理論等電點(diǎn)為4.94,預(yù)估半衰期為30小時(shí),不穩(wěn)定系數(shù)為25.72,脂肪族氨基酸指數(shù)為85.53,總平均親水系數(shù)為-0.242,提示GadA為穩(wěn)定性親水蛋白。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示短乳桿菌CD0817的谷氨酸脫羧酶GadA蛋白是由三條多肽鏈經(jīng)α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲形成的非對(duì)稱三聚體。(4)建立了一種鑒定基因組已知區(qū)域側(cè)翼未知DNA序列的新型基因組步移方法——引物階梯式部分重疊PCR。與傳統(tǒng)的引物部分重疊PCR方法相比,引物階梯式部分重疊PCR方法需要更少的引物且適合于配置預(yù)混液,具有簡(jiǎn)單性和高效性的優(yōu)點(diǎn)。引物階梯式部分重疊PCR作為現(xiàn)有基因組步移方法的一種替代方案,可應(yīng)用于染色體測(cè)序工作中的gap填補(bǔ),以獲得完整的基因組序列。
【圖文】：

功能、進(jìn)化、繪圖和編輯的交叉學(xué)科。與遺傳學(xué)（Genetics）有所不同，遺傳學(xué)研究的是個(gè)體基因及其在進(jìn)化中的作用，而基因組學(xué)旨在對(duì)基因進(jìn)行整體表征和定量�；蚪M學(xué)的發(fā)展引發(fā)了基礎(chǔ)科學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)的革命，促進(jìn)了人們對(duì)最復(fù)雜生物系統(tǒng)（如大腦）的深入理解[70]。1.4.1 微生物基因組測(cè)序策略生物體的核苷酸序列中蘊(yùn)藏著其遺傳和生化特性信息，因此測(cè)序技術(shù)在現(xiàn)代生物學(xué)中是一種不可或缺的研究手段。自 1977 年 Sanger 和 Coulson 發(fā)明第一代測(cè)序技術(shù)（雙脫氧鏈終止法）[71]以來(lái)的四十多年間，研究人員投入了大量的時(shí)間和精力來(lái)不斷開發(fā)和改進(jìn)測(cè)序技術(shù)，至今已發(fā)展至第三代（乃至第四代）。圖 1-3（摘自網(wǎng)絡(luò)，，原始出處不詳）展示了自 1952 年 Hershey 和 Chase 證明 DNA是遺傳物質(zhì)[72]以來(lái)測(cè)序技術(shù)的發(fā)展歷程。從第一代到第三代測(cè)序技術(shù)，測(cè)序讀長(zhǎng)由長(zhǎng)到短，再由短到長(zhǎng)，測(cè)序效率越來(lái)越高，測(cè)序范圍和規(guī)模逐步擴(kuò)大，成本逐漸降低，測(cè)序技術(shù)取得了巨大的發(fā)展。目前，測(cè)序技術(shù)已應(yīng)用于臨床診斷以及包括疾病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)、治療鑒定和產(chǎn)前檢測(cè)在內(nèi)的醫(yī)療護(hù)理的其他方面[73]。

碳水化合物活性酶（Carbohydrate-active en注釋。因組 DNA 提取0817 基因組 DNA 樣品的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見表 2-1。結(jié)果顯示，所提取基因組較好，濃度（＞20 ng/μL）和純度（OD260整體質(zhì)量滿足建庫(kù)測(cè)序要求。-1 短乳桿菌 CD0817 基因組 DNA 樣品質(zhì)量檢測(cè)ality control results of Lactobacillus brevis CD0817（ng/μL） OD260/OD280OD260/OD230151.2 1.838 1.417 樣品質(zhì)量
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q933;TQ226.36

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本文編號(hào)：2700149