發(fā)布時(shí)間：2020-06-05 01:25

【摘要】：本課題從豐富和可再生的油酸原料出發(fā),使用油酸水合酶生物催化合成生物可降解性化學(xué)品10-羥基硬脂酸;同時(shí)將上述油酸水合酶與10-羥基硬脂酸脫氫酶級(jí)聯(lián),催化油酸轉(zhuǎn)化直接合成更加有用的10-羰基硬脂酸。上述酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng),不僅條件溫和、時(shí)空產(chǎn)率高,而且反應(yīng)產(chǎn)物10-羰基硬脂酸經(jīng)過(guò)進(jìn)一步裂解和轉(zhuǎn)化后,可以合成多種高附加值的中鏈二元酸、羥基酸和ω-氨基酸等功能化學(xué)品。本課題的研究?jī)?nèi)容主要分為以下三個(gè)部分:(1)油酸水合酶的篩選。以已報(bào)道的油酸水合酶的蛋白序列為探針,在生物數(shù)據(jù)庫(kù)中挖掘、篩選潛在的油酸水合酶。從實(shí)驗(yàn)室保藏的菌種庫(kù)和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中挑選不同類型的菌株和基因組進(jìn)行克隆,在大腸桿菌(Escherichia coli)中進(jìn)行異源表達(dá),并測(cè)定其對(duì)油酸的水合能力。其中來(lái)源于Paracoccus aminophilus的油酸水合酶(簡(jiǎn)稱PaOH)表現(xiàn)出較高的活力。(2)PaOH的表征與酶促水合反應(yīng)的優(yōu)化。PaOH在pH 6.5、30℃和4%(v/v)DMSO(助溶劑)的存在下展現(xiàn)出最高活力。在最適條件下,測(cè)得PaOH的比活力為5.21U·mg-1。PaOH的催化效率常數(shù)(kcat/KM)為10,700min-1·mM-1,是目前已知油酸水合酶中最高的。25℃與30℃下PaOH的半衰期分別為4.05 h和3.02 h。對(duì)PaOH催化的油酸水合反應(yīng)的底物和催化劑上載量進(jìn)行了優(yōu)化,當(dāng)?shù)孜锷陷d量為90 g·L-1,酶粉加入量為10 g·L-1,反應(yīng)進(jìn)行4 h后,轉(zhuǎn)化率達(dá)96.1%,時(shí)空產(chǎn)率為552 g·L-1·d-1。產(chǎn)品最終的分離得率為67.9%(mol/mol),純度達(dá)99.3%。(3)水合酶與脫氫酶的級(jí)聯(lián)催化反應(yīng)。因?yàn)?0-羥基硬脂酸脫氫酶(MlDH)的酶促反應(yīng)需要昂貴的輔酶NAD+作為輔底物,所以需要構(gòu)建一個(gè)輔酶循環(huán)再生的體系。經(jīng)過(guò)分析比較,本文選用乳酸脫氫酶(LDH)與MlDH進(jìn)行偶聯(lián),以實(shí)現(xiàn)輔酶的循環(huán)再生。為了使水合酶PaOH的催化能力達(dá)到最大,我們采用一鍋兩步的反應(yīng)方式進(jìn)行級(jí)聯(lián)催化。在底物上載量為90 g·L-1,PaOH酶粉加入量為10 g·L-1,NAD+添加量為0.1 mM,LDH與MlDH酶粉的加入量分別為0.5 g·L-1的條件下,反應(yīng)10 h后油酸轉(zhuǎn)化率達(dá)95.0%。最終產(chǎn)品10-羰基硬脂酸的分離得率為51.9%(mol/mol),純度達(dá)99.0%。
【圖文】：

報(bào)道了一個(gè)含有黃素腺嘌呤二核苷酸（ＦＡＤ）的油酸水合酶晶體結(jié)構(gòu)，該油酸水合酶來(lái)自逡逑為了得到蛋白與輔因子的復(fù)合物，在純化過(guò)程的最后一逡逑步加入ＦＡＤ溫育，得到的晶體結(jié)構(gòu)如圖１．４，分辨率為２．７５埃，該結(jié)構(gòu)是由兩個(gè)蛋白分逡逑子結(jié)晶得到的不對(duì)稱同型二聚體。在Ａ鏈中，ＦＡＤ非共價(jià)結(jié)合在Ｒｏｓｓｍａｎ型結(jié)構(gòu)域和逡逑底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域的界面｜３３］。逡逑基于結(jié)構(gòu)和功能分析，Ｅｎｇｌｅｄｅｒ等提出了黃素依賴型水合酶的反應(yīng)機(jī)理，其中氨基逡逑酸Ｅ１２２和Ｙ２４１在Ｃ邋＝邋Ｃ雙鍵的水合作用中起酸堿催化劑的作用，且ＦＡＤ在活性位點(diǎn)逡逑的正確組織中扮演著重要角色。逡逑圖１．４來(lái)源于的油酸水合酶（同型二聚體）結(jié)構(gòu)逡逑Ｆｉｇｕｒｅ］邋．４０ｖｅｒａｌｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｏｌｅａｔｅ邋ｈｙｄｒａｔａｓｅ邋（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）邋ｆｒｏｍ邋Ｅｌｉｚａｂｅｔｈｋｉｎｇｉａ邋ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃａ．邋Ｒｉｂｂｏｎ逡逑ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ａｎ邋ＯｈｙＡ邋ｄｉｍｅｒ邋ａｓ邋ｐｒｅｓｅｎｔ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｃｒｙｓｔａｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．邋Ｃｈａｉｎ邋Ａ邋ｉｓ邋ｓｈｏｗｎ邋ｉｎ邋ｇｒｅｙ邋ａｎｄ邋ｃｈａｉｎ邋Ｂ邋ｉｎ逡逑ｍａｇｅｎｔａ．邋ＦＡＤ邋（ｙｅｌｌｏｗ）邋ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ邋ｐｒｅｓｅｎｔ邋ｉｎ邋ｃｈａｉｎ邋Ａ邋ａｒｅ邋ｓｈｏｗｎ邋ｉｎ邋ｓｔｉｃｋ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ．逡逑１．２．３油酸水合酶的分類逡逑２０１７邋年，韓國(guó)邋Ｗｏｏ－Ｒｉ邋Ｋａｎｇ邋等人在嗜麥芽窄食單胞菌逡逑中發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的油酸水合酶，新發(fā)現(xiàn)的油酸水合酶與之前在該菌株中發(fā)現(xiàn)的水合酶之間逡逑存在一定的差異。作者根據(jù)兩個(gè)酶ＦＡＤ結(jié)合基序的差異

接下來(lái)Ｗｏｏ－Ｒ！邋Ｋａｎｇ等嘗試從蛋白氨基酸序列的角度去解釋這個(gè)現(xiàn)象。眾所周知，逡逑谷胱甘肽還原酶家族的所有成員，包括ＯｈｙＡ，，都含有一個(gè)相同的基序，即五個(gè)保守殘逡逑基的ＦＡＤ結(jié)合基序ＧＸＧＸＸＳ（ａ／ｇ）Ｘｉ５Ｅ（ｄ）Ｘ５Ｅ（Ｘ表示任何氨基酸）。如圖１．５中，將己表逡逑征過(guò)的油酸水合酶進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)ＯｈｙＡｌ型油酸水合酶的第四個(gè)保守殘基是Ｅ（Ｄ），逡逑而這個(gè)殘基在０ｈｙＡ２型油酸水合酶中不是保守的。將來(lái)自＊Ｓ．邐的兩類油酸水逡逑合酶序列上的第四個(gè)氨基酸進(jìn)行突變：Ｓｍ－ＯｈｙＡｌ突變?yōu)椋牛樱希粒粒恚希瑁粒谕蛔優(yōu)椋眩福埃�。逡逑通過(guò)添加ＦＡＤ，野生型ＯｈｙＡｌ的活性顯著增加，突變體ＯｈｙＡｌＥ５ＱＡ的活性沒(méi)有影響；逡逑而野生型ＯｈｙＡ２和突變體ＯｈｙＡ２（ｊ８0Ｅ表現(xiàn)出相反的特性。因此，第四個(gè)保守氨基酸可逡逑能是區(qū)分ＯｈｙＡ類型的關(guān)鍵。逡逑ＦＡＤ－ｂｉｎｄｉｎｇ邋ｍｏｔｉｆ逡逑２０邐ＶＤＥＫＳＡＭＪＨＰｆ＾ＡＡＣＦＬＩＲＤＧＣＭＫＧｆｌｌＨＩＬｐＤＩＳＱＳＳＬＤＧＩＵＰＴＲＧＦＩ邋ＩＲ３／．觸
【學(xué)位授予單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：TQ426;TQ225.4

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本文編號(hào)：2697278