【摘要】：多糖廣泛分布于植物、微生物、動(dòng)物及水藻中,大量研究證實(shí)天然植物多糖具有抗氧化、抗疲勞、抗過敏、抗腫瘤、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、降血糖和益生等諸多生理活性。相較于人工合成藥物,植物多糖還具有作用效果相對(duì)較好、毒副作用小、安全性高等優(yōu)點(diǎn),被認(rèn)為是合成藥物的理想替代品。因此,從新植物原料中尋找活性多糖并對(duì)其結(jié)構(gòu)、生物活性等進(jìn)行分析已逐步成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。我國竹筍資源豐富,作為世界最大的竹筍生產(chǎn)國和消費(fèi)國,鮮筍年產(chǎn)量高達(dá)500~600萬噸。由于新鮮竹筍易褐變和木質(zhì)化,導(dǎo)致其保質(zhì)期不長,同時(shí),其上市周期較短和集中。因此,大量的鮮筍需要進(jìn)一步加工保藏如腌制、干制和制作罐頭等,但目前加工中存在的普遍問題是竹筍加工過程中原料浪費(fèi)嚴(yán)重,如筍衣、筍渣和筍頭等加工副產(chǎn)物占到了竹筍原料的50%~70%,而這部分加工副產(chǎn)物只有少量用做動(dòng)物飼料,大部分副產(chǎn)物都被丟棄,造成竹筍原料的浪費(fèi)及環(huán)境污染。方竹(Chimonobambusa quadrangularis)因其竹稈呈四棱形略方而得名,是著名的珍貴竹種之一,其竹筍質(zhì)量好,味道鮮美,深受市場歡迎。然而,方竹筍作為重慶、貴州特有的竹筍資源,在加工過程中也面臨大量加工副產(chǎn)物未得到有效利用和開發(fā)的問題。因此,提高方竹筍加工副產(chǎn)物的利用率、開發(fā)相關(guān)的高附加值產(chǎn)品是目前方竹筍加工中急需解決的問題。而目前國內(nèi)外關(guān)于方竹筍多糖的提取、結(jié)構(gòu)解析及生理活性的研究還未見有報(bào)道�；诖�,本實(shí)驗(yàn)以方竹筍加工副產(chǎn)物的廢筍渣為研究對(duì)象,瞄準(zhǔn)其中的多糖活性成分,對(duì)方竹筍的加工廢筍渣中多糖的提取方法進(jìn)行研究,同時(shí)對(duì)比不同提取方法對(duì)方竹筍多糖理化性質(zhì)和體外抗氧化及益生活性的影響,在此基礎(chǔ)上對(duì)方竹筍多糖進(jìn)行分離和純化并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析,再研究方竹筍多糖純化組分的體外模擬消化和酵解特征,最后研究方竹筍多糖純化組分對(duì)葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的小鼠急性潰瘍性腸炎的影響及機(jī)理,以期為方竹筍多糖臨床藥物和保健食品的開發(fā)以及方竹筍加工副產(chǎn)物的高附加值轉(zhuǎn)化提供理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。主要研究結(jié)果如下:(1)方竹筍的加工廢筍渣中多糖的快速溶劑提取工藝研究采用快速溶劑提取(ASE)技術(shù)提取方竹筍的加工廢筍渣中的多糖,以粗多糖得率為評(píng)價(jià)指標(biāo),通過單因素和響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)對(duì)其提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。同時(shí)與常規(guī)熱水提取法(HWE)進(jìn)行對(duì)比,考察采用上述兩種方法提取得到的方竹筍多糖在得率、主要化學(xué)組成、熱穩(wěn)定性和流變學(xué)性質(zhì)方面的差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,方竹筍的加工廢筍渣中多糖快速溶劑提取的最佳提取工藝條件為:筍渣粒徑Φ250 380μm,提取溫度126°C,循環(huán)次數(shù)2次,單次循環(huán)提取時(shí)間22 min。最佳提取條件下,方竹筍粗多糖的得率為9.96±0.39%,顯著高于傳統(tǒng)熱水提取法的得率(7.16±0.32%,p0.05),其提取時(shí)間遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)熱水提取法的單次提取時(shí)間(4 h),而兩種提取方法提取的方竹筍多糖其總糖含量和熱穩(wěn)定性無顯著差異。靜態(tài)流變學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,ASE提取得到的方竹筍多糖(ASE-CPS)和熱水提取法提取得到的方竹筍多糖(HWE-CPS),其溶液都表現(xiàn)出剪切變稀的假塑性流體特征,表觀粘度都隨著其濃度增加而增大,在相同濃度條件下,ASE-CPS的表觀粘度更大;添加CaCl_2會(huì)降低ASE-CPS和HWE-CPS溶液的表觀粘度,添加相同濃度的CaCl_2溶液,HWE-CPS溶液的表觀粘度降低的更多。動(dòng)態(tài)流變學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,HWE-CPS和ASE-CPS為弱凝膠型多糖,添加CaCl_2可降低HWE-CPS和ASE-CPS的凝膠強(qiáng)度,且添加相同濃度的CaCl_2,HWE-CPS的凝膠強(qiáng)度降低的更多。以上結(jié)果說明,與傳統(tǒng)熱水提取法比較,ASE可作為方竹筍的加工廢筍渣中多糖的高效提取方法。(2)不同提取方法對(duì)方竹筍多糖理化性質(zhì)和生物活性影響的研究分別采用快速溶劑提取、熱水提取、超聲輔助提取、微波輔助提取和復(fù)合酶輔助提取五種提取方法提取方竹筍的加工廢筍渣中的多糖,對(duì)其初步純化,最終得到5個(gè)對(duì)應(yīng)的多糖樣品,并對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行比較;再采用體外化學(xué)抗氧化法綜合比較5個(gè)多糖樣品的氧化自由基吸收能力(ORAC),清除DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基和ABTS自由基的能力,金屬離子螯合力和還原力;考察5個(gè)多糖樣品在人工胃液和α-淀粉酶液中的穩(wěn)定性;將上述5個(gè)多糖樣品作為碳源,加入到無碳源的MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,分別接種青春雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌4種益生菌菌種,通過體外厭氧發(fā)酵實(shí)驗(yàn),對(duì)比不同多糖樣品對(duì)益生菌的體外增殖效果及產(chǎn)生短鏈脂肪酸的情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,不同提取方法顯著影響方竹筍多糖的得率和某些理化性質(zhì),同時(shí)顯著影響方竹筍多糖的體外抗氧化活性和益生活性,但對(duì)方竹筍多糖在人工胃液和α-淀粉酶液中的穩(wěn)定性無顯著影響,不同提取方法制備的方竹筍多糖在人工胃液和α-淀粉酶液中均表現(xiàn)出較強(qiáng)的穩(wěn)定性(在人工胃液中水解率1.3%,在α-淀粉酶液中水解率5.0%)。理化性質(zhì)方面,不同提取方法影響方竹筍多糖的得率、化學(xué)組成、單糖組成、分子量、粒徑大小、Zeta電位和三股螺旋構(gòu)象�？焖偃軇┨崛》ǖ亩嗵堑寐首罡�,超聲輔助提取法制備的方竹筍多糖其糖醛酸含量最高、平均分子量最小、平均粒徑最小、Zeta電位的絕對(duì)值最大;體外抗氧化活性方面,五種提取方法制備的方竹筍多糖均表現(xiàn)出一定的抗氧化能力,超聲輔助提取法制備的方竹筍多糖具有更強(qiáng)的氧化自由基吸收能力,更強(qiáng)的清除DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基和ABTS自由基能力及更強(qiáng)的Fe~(2+)螯合力和還原力;體外益生活性方面,五種提取方法制備的方竹筍多糖均表現(xiàn)出顯著的益生活性,超聲輔助提取法和復(fù)合酶輔助提取法制備的方竹筍多糖對(duì)促進(jìn)青春雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌體外增殖的效果更佳,能促進(jìn)上述四種益生菌產(chǎn)生更多的短鏈脂肪酸。(3)方竹筍的加工廢筍渣中多糖的分離純化、理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)解析建立DEAE cellulose-52陰離子交換柱和Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱兩步法分離純化方竹筍多糖工藝技術(shù)路線,對(duì)方竹筍廢筍渣中多糖進(jìn)行分離純化,進(jìn)一步對(duì)方竹筍多糖純化組分進(jìn)行純度鑒定及分子量測定,最后采用化學(xué)分析結(jié)合儀器分析法對(duì)方竹筍多糖純化組分的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。研究結(jié)果表明,對(duì)方竹筍粗多糖進(jìn)行分離純化,最終得到PCPS-1和PCPS-2兩個(gè)純化組分,其總糖含量分別為93.26%和92.25%,糖醛酸含量分別為0.28%和0.65%,平均分子量分別為24.58 kDa和123.45 kDa;PCPS-1和PCPS-2均由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖組成,PCPS-1對(duì)應(yīng)的上述單糖摩爾百分含量分別為0.54%、0.49%、0.33%、5.93%、46.79%和45.93%,PCPS-2對(duì)應(yīng)的上述單糖摩爾百分含量分別為0.46%、1.57%、1.40%、3.36%、45.82%、和47.38%;高碘酸氧化和Smith降解、甲基化分析、氣質(zhì)聯(lián)機(jī)和核磁共振分析結(jié)果表明,PCPS-1和PCPS-2均主要由→5)-α-L-Araf-(1→、→3,5)-α-L-Araf-(1→、→6)-β-D-Galp-(1→、→3,6)-β-D-Galp-(1→、T-β-D-Galp、→3)-β-D-Galp-(1→和T-α-D-Glcp七種糖苷鍵組成,其中PCPS-1對(duì)應(yīng)的上述糖苷鍵摩爾百分含量分別為37.16%、9.01%、17.38%、14.22%、11.19%、6.08%和4.95%;PCPS-2對(duì)應(yīng)的上述糖苷鍵摩爾百分含量分別為32.87%、16.81%、16.86%、13.73%、5.91%、10.67%和3.14%;掃描電鏡結(jié)果表明,PCPS-1主要呈片狀結(jié)構(gòu),表面比較平整,而PCPS-2主要呈棒狀結(jié)構(gòu),表面比較光滑;原子力顯微鏡和圓二色譜結(jié)果顯示,PCPS-1和PCPS-2分子在水溶液中均以不規(guī)則的聚合體存在;X衍射結(jié)果表明,PCPS-1和PCPS-2中只含有少量的微晶結(jié)構(gòu),主要以無定型形態(tài)存在。(4)方竹筍多糖PCPS-2的體外模擬消化及酵解特征的研究采用人體唾液、體外模擬胃液及小腸液消化模型,研究方竹筍多糖純化組分PCPS-2的體外消化特征,并使用DEAE cellulose-52陰離子交換柱對(duì)PCPS-2的消化產(chǎn)物進(jìn)行純化,再采用核磁共振技術(shù)對(duì)其主要糖苷鍵進(jìn)行分析,用于比較PCPS-2消化前后主要糖苷鍵是否發(fā)生變化;同時(shí),以人體糞便微菌群為酵解模型,研究方竹筍多糖的體外酵解特征。研究結(jié)果表明,PCPS-2在人體唾液、模擬胃液和小腸液中穩(wěn)定性較好,PCPS-2經(jīng)人體唾液、模擬胃液和小腸液消化后,其分子量和還原糖含量未發(fā)生顯著變化,也未釋放游離單糖;方竹筍多糖PCPS-2經(jīng)體外模擬消化后的核磁共振圖譜結(jié)果表明,PCPS-2經(jīng)唾液、模擬胃液和小腸液消化后其主要糖苷鍵并未發(fā)生顯著變化;體外酵解實(shí)驗(yàn)顯示,發(fā)酵24 h后,PCPS-2中53.36%的總糖被腸道微生物分解利用,發(fā)酵液的pH值由8.18降低到5.31,發(fā)酵液中α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和β-D-半乳糖苷酶的活性顯著增加(p0.05),發(fā)酵液中乳酸、乙酸、丙酸和總SCFAs的濃度分別從0.64、1.73、0.38和3.11 mmol/L顯著增加到8.95、14.03、7.16和31.37 mmol/L。以上結(jié)果說明,PCPS-2可被腸道微生物分解利用,能夠顯著促進(jìn)腸道微生物產(chǎn)生SCFAs,乳酸、乙酸和丙酸為其主要的SCFAs產(chǎn)物。(5)方竹筍多糖PCPS-2對(duì)小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎的影響及其機(jī)理研究采用3%DSS誘導(dǎo)BALB/c雄性小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎模型,考察方竹筍多糖PCPS-2膳食干預(yù)下對(duì)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的作用效果,同時(shí)采用酶聯(lián)免疫技術(shù)、qRT-PCR技術(shù)和Western blot等技術(shù)考察PCPS-2對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸中炎癥細(xì)胞因子、iNOS和COX-2炎癥蛋白、NLRP3炎癥小體和NF-κB信號(hào)通路的影響,探討PCPS-2的可能作用機(jī)制。研究結(jié)果表明,PCPS-2對(duì)DSS誘導(dǎo)的小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎具有顯著的保護(hù)作用,具體表現(xiàn)為:PCPS-2可顯著改善由DSS誘發(fā)的小鼠體重減輕、糞便隱血、結(jié)腸縮短、結(jié)腸水腫與潰瘍、脾臟腫大等癥狀;可有效降低DSS對(duì)結(jié)腸組織的損傷,結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸粘膜的潰瘍得到改善,炎性細(xì)胞的浸潤減少,隱窩結(jié)構(gòu)得到一定程度恢復(fù)。PCPS-2對(duì)DSS誘導(dǎo)的小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎的保護(hù)作用主要通過以下幾種方式實(shí)現(xiàn):降低結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸中促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-18的表達(dá)量,改善結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸中促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和IL-18與抗炎細(xì)胞因子IL-10間的平衡狀態(tài);通過降低結(jié)腸炎小鼠血清中NO分泌量、減少結(jié)腸組織中MDA含量、提高T-SOD活力、降低MPO活力從而抑制結(jié)腸炎小鼠機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng),修復(fù)組織損傷;下調(diào)結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸中炎癥蛋白iNOS和COX-2的表達(dá);抑制結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸中NLRP3炎癥小體的激活;抑制結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸的NF-κB信號(hào)通路中p65和IκB-α蛋白的磷酸化。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)成功建立了方竹筍的加工廢筍渣中多糖的快速溶劑提取新工藝,同時(shí)建立了DEAE cellulose-52陰離子交換柱和Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱兩步法分離純化方竹筍多糖工藝技術(shù)路線;證實(shí)了提取方法顯著影響方竹筍多糖的體外抗氧化活性和益生活性,其中超聲輔助提取法制備的方竹筍多糖表現(xiàn)出更顯著的體外抗氧化活性和益生活性;方竹筍多糖純化組分PCPS-1和PCPS-2的主要結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為兩個(gè)純化組分均主要含→3,5)-α-L-Araf-(1→、→5)-α-L-Araf-(1→、→6)-β-D-Galp-(1→、→3,6)-β-D-Galp-(1→、T-β-D-Galp、→3)-β-D-Galp-(1→和T-α-D-Glcp七種糖苷鍵;證實(shí)了PCPS-2可抵抗人體唾液、模擬胃液和小腸液的消化作用,且經(jīng)體外模擬消化后其主要糖苷鍵并未發(fā)生顯著變化;進(jìn)一步證明了PCPS-2能夠被腸道微生物分解利用,能夠顯著促進(jìn)腸道微生物產(chǎn)生乳酸、乙酸和丙酸;最后發(fā)現(xiàn)PCPS-2對(duì)DSS誘導(dǎo)的小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎具有顯著的保護(hù)作用,證明其主要通過降低潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸中促炎細(xì)胞因子、炎癥蛋白iNOS和COX-2的表達(dá),改善結(jié)腸炎小鼠機(jī)體的氧化應(yīng)激,抑制結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸中NLRP3炎癥小體的激活,抑制結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸的NF-κB信號(hào)通路中p65和IκB-α蛋白的磷酸化這幾種方式實(shí)現(xiàn)對(duì)小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎的保護(hù)作用。
【圖文】：

圖 1-1 從竹筍加工副產(chǎn)物和廢水中開發(fā)附加值產(chǎn)品的生物精煉建議流程圖[30]Fig. 1-1 Proposed flow chart for abiorefinery approach to the development of value-added producfrom waste bamboo shoot processing residue and processing waste water.2 植物多糖的研究進(jìn)展.2.1 多糖簡介多糖（Polysaccharides）是由酮糖、醛糖或其衍生物通過不同類型的糖苷鍵而成的天然高分子聚合物。多糖廣泛分布于高等植物和微生物的細(xì)胞壁及動(dòng)胞膜中，除為機(jī)體的結(jié)構(gòu)物質(zhì)和為機(jī)體提供能量物質(zhì)外，還廣泛參與機(jī)體的合成反應(yīng)及細(xì)胞的各項(xiàng)生命活動(dòng)，如細(xì)胞的識(shí)別、細(xì)胞間信號(hào)通路的傳導(dǎo)等[3有生物活性的多糖一般指由十個(gè)以上單糖分子通過糖苷鍵連接起來的線性或支鏈的高分子聚合物，，其分子量分布范圍較廣泛，可從數(shù)萬到幾百萬[36]。多據(jù)原料來源的不同，可分為植物多糖、微生物多糖和動(dòng)物多糖；根據(jù)其分子分支情況，可以分為直鏈多糖和支鏈多糖。與蛋白質(zhì)類似，多糖的結(jié)構(gòu)可分級(jí)、二級(jí)、三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)，但多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)包含的信息較蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)

圖 1-2 植物多糖不同提取方法的機(jī)理[53]-2 The mechanism of different extraction methods for plant polysac取法的溶劑提取法根據(jù)提取溶劑的不同，又分為熱水提取法。水提取法：該方法為植物多糖提取廣泛采用的方法，將多糖提取液，利用多糖不溶于有機(jī)試劑溶于水的性質(zhì)，離心后收集沉淀得到粗多糖。提取時(shí)間、溫度、料搖為多糖提取效率的影響因素。該方法的優(yōu)點(diǎn)是操作要提取 2～6 h，某些大分子多糖不溶于熱水[55]（表 1-堿提取法：某些不溶于熱水的酸性多糖或大分子多糖可選用 5～15%（w/w）的 NaOH 或 Na2CO3溶液為提取降解，提取溫度不能超過 10 °C。該方法的優(yōu)點(diǎn)是多糖需嚴(yán)格控制溫度，多糖可能發(fā)生部分降解[56]（表 1-2）酸提取法：由于植物多糖在酸性條件下易發(fā)生降解，其
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：TQ281;TS209

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2693339