【摘要】：卡那霉素是一種含有2-脫氧鏈霉胺(DOS)的氨基糖苷類(AmAc)抗生素,已經(jīng)保持了幾十年的廣譜抗菌活性。近年來,由于致病菌耐藥性的出現(xiàn)使得卡那霉素的臨床應用受到了限制,卡那霉素半合成衍生物,如阿米卡星、地貝卡星和阿貝卡星等已被廣泛用于解決抗藥性的問題。目前,我們實驗室已經(jīng)成功設計和優(yōu)化了從卡那霉素B到地貝卡星和阿貝卡星的化學合成路線,并且達到了較高的收率。然而,卡那霉素B的供應不足嚴重限制了其產(chǎn)量,導致這類抗生素的價格昂貴。在未經(jīng)改造的卡那霉素鏈霉菌的代謝產(chǎn)物中,卡那霉素A是主要產(chǎn)物,卡那霉素B作為副產(chǎn)物,其產(chǎn)量僅為卡那霉素A的1/9。為解決卡那霉素B供不應求的問題,構建富產(chǎn)卡那霉素B的工程菌株具有迫切性和重要意義。首先針對kanJ基因設計了 2條不同的sgRNA,通過酶切酶連的方式分別連接在pCRISPR-Cas9原始質(zhì)粒上,再通過Gibson組裝在StuI位點插入kanJ的左右同源臂,為其進行同源修復提供模板。成功構建kanJ敲除質(zhì)粒后,通過接合轉(zhuǎn)移的方式使其進入卡那霉素鏈霉菌中,在硫鏈絲菌素的作用下激活Cas9蛋白,成功敲除kanJ基因�！鱧anJ菌株發(fā)酵產(chǎn)物中卡那霉素B的平均產(chǎn)量可達到537.20 mg/L,相較于野生型菌株,卡那霉素B的產(chǎn)量提高了將近10.7倍�！� kanJ菌株的發(fā)酵產(chǎn)物中僅含有卡那霉素B,實現(xiàn)了單產(chǎn)卡那霉素B。其次探討了卡那霉素代謝途徑中調(diào)控基因kanG、kanL的功能。分別構建kanG、kanL多表達質(zhì)粒,通過接合轉(zhuǎn)移的方法,將kanG、kanL多表達質(zhì)粒分別整合在卡那霉素鏈霉菌的基因組上,最終通過抗性篩選得到了kan 多表達菌株和kanL多表達菌株。kanG多表達菌株的發(fā)酵產(chǎn)物中卡那霉素A的產(chǎn)量為387.00 mg/L,卡那霉素B的產(chǎn)量為46.66 mg/L。kanL多表達菌株的發(fā)酵產(chǎn)物中卡那霉素A的產(chǎn)量為408.07 mg/L,卡那霉素B的產(chǎn)量為51.62 mg/L。
【圖文】：

圖１－１卡那霉素Ｂ、地貝卡星、阿貝卡星的化學結構逡逑Ｆｉｇ．１－１邋Ｔｈｅ邋ｃｈｅｍｉｃａｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｋａｎａｍｙｃｉｎ邋Ｂ＞邋ｄｉｂｅｋａｃｉｎ、ａｒｂｅｋａｃｉｎ逡逑１逡逑

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【學位授予單位】：北京化工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：TQ927

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本文編號：2690153