【摘要】：蛋白質(zhì)是人體細(xì)胞、組織、器官的重要組成成分,是一切生命的物質(zhì)基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)與人體的各種生理活動,如維持肌體正常的新陳代謝、保障各類物質(zhì)在體內(nèi)的正常輸送、保證各種免疫活動的正常進(jìn)行等,有著密切的關(guān)系。研究表明,人類的某些疾病的發(fā)生與蛋白質(zhì)的異常表達(dá)也密切相關(guān)。因此開發(fā)靈敏、簡單、快速的蛋白質(zhì)檢測方法對蛋白質(zhì)性質(zhì)、功能的深入研究以及相關(guān)疾病的臨床診斷,藥物研究等都具有非常重要的意義。小分子連接DNA末端保護(hù)是利用DNA鏈上標(biāo)記的小分子與蛋白質(zhì)特異性結(jié)合,能夠有效阻止外切酶對DNA鏈的降解的作用。在末端保護(hù)中DNA序列無編碼限制,DNA末端易于標(biāo)記,而且不影響DNA序列和標(biāo)記分子的活性,易與DNA擴(kuò)增手段結(jié)合,這些優(yōu)勢為蛋白質(zhì)的檢測提供了新的思路。因此,近年來基于小分子連接DNA末端的保護(hù)原理檢測蛋白質(zhì)的方法受到人們的廣泛關(guān)注。本論文基于小分子連接DNA末端的保護(hù)原理分別結(jié)合兩種金屬納米材料-銀納米簇和金納米粒子,構(gòu)建了兩種檢測蛋白質(zhì)的新方法,主要內(nèi)容如下:一、基于小分子連接DNA末端保護(hù)結(jié)合銀納米簇(AgNCs)熒光檢測蛋白質(zhì)。首先設(shè)計了一條3'端標(biāo)記小分子生物素(biotin)的單鏈DNA探針,當(dāng)沒有靶蛋白-鏈霉親和素(STV)時,biotin標(biāo)記的DNA探針被Exo I從3'端降解。加入具有強(qiáng)熒光的AgNCs,AgNCs本身的熒光不會受到影響;當(dāng)STV存在時,STV與biotin特異性結(jié)合,保護(hù)DNA探針不被Exo I降解。DNA探針與加入的AgNCs 3'端裸露出的序列雜交,能夠猝滅AgNCs的熒光。熒光信號降低的程度與靶蛋白質(zhì)STV的量具有一定的定量關(guān)系。實驗結(jié)果表明,在2~40 pmol范圍內(nèi),熒光信號與STV的量具有良好的線性關(guān)系,檢出限為1.82 pmol STV。該方法簡單、成本低廉,特異性良好,但方法靈敏度有待于進(jìn)一步改善。二、基于小分子連接DNA末端保護(hù)結(jié)合金納米粒子(AuNPs)可視化檢測蛋白質(zhì)。我們設(shè)計了一條3'端標(biāo)記biotin的單鏈DNA探針,當(dāng)目標(biāo)蛋白STV不存在時,加入Exo I后DNA探針被降解,AuNPs沒有單鏈DNA探針保護(hù),在一定的鹽離子濃度下發(fā)生聚集,溶液呈藍(lán)色;當(dāng)靶蛋白STV存在時,STV與DNA探針上的biotin特異性結(jié)合,從而保護(hù)DNA探針不會被Exo I降解。帶負(fù)電的DNA單鏈探針通過靜電結(jié)合吸附在AuNPs的表面,阻止了鹽離子引起的AuNPs的聚集。分散的AuNPs溶液呈紅色。通過AuNPs溶液聚沉前后溶液顏色以及吸光度的變化對目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析。吸光度比值A(chǔ)_(550 nm)/A_(700 nm)與STV的量在2~20 pmol的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,STV的檢出限為1.40 pmol。該方法不需要貴重的儀器設(shè)備,利用裸眼觀察即可得到檢測結(jié)果,更加便捷。
【圖文】：

是基于抗原和抗體的特異性識別而建立的一種檢測法[10-11]。根據(jù)反應(yīng)中是否標(biāo)有示蹤物，免疫分析法標(biāo)記免疫分析。非標(biāo)記免疫分析法是通過將待測抗原發(fā)生特異性吸附反應(yīng)，可直接產(chǎn)生光信號或者電放射性核素、熒光素、鐵蛋白、酶、化學(xué)發(fā)光劑等上制成示蹤物質(zhì)，與相應(yīng)的抗原或者抗體反應(yīng)。通儀等儀器對抗原或抗體進(jìn)行定性或定量測定。標(biāo)記分析方法，所以標(biāo)記免疫分析方法在蛋白質(zhì)的應(yīng)用免疫分析法。體相互作用的放射免疫分析法法 (Radioimmunoassay，RIA) 是 Yalow 和 Berson[標(biāo)記抗原或抗體的免疫學(xué)檢測方法。基本原理如圖與未標(biāo)記的抗原與一定量的特異性抗體產(chǎn)生特異性

故這兩者存在一定的函數(shù)關(guān)系，所以可以測定出待測抗原分析法的靈敏度高、簡便、通用，被廣泛應(yīng)用到生物學(xué)和醫(yī)、藥物等[13-15]。然而一些不可避免的缺點，如實驗重復(fù)性差反應(yīng)、假陽性反應(yīng)，放射性物質(zhì)對污染環(huán)境，對人身體有害法的應(yīng)用[16]。原抗體相互作用的酶聯(lián)免疫吸附分析法吸附反應(yīng) (Enzyme-linked Immuno-sorbent Assay，ELISA的。其原理如圖 1-2 所示：首先將酶作為標(biāo)記物通過共價鍵，，加入待測樣品后，待測樣品和酶標(biāo)記的抗原或抗體與吸附發(fā)生特異性結(jié)合，形成固相抗原 (抗體) -待測抗體 (抗原明治”結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)遇到酶的反應(yīng)底物后會被酶催化產(chǎn)生顏光反應(yīng)等。之后，研究人員基于 ELISA 結(jié)合熒光、化學(xué)發(fā)立了各種蛋白質(zhì)分析方法[18-20]。
【學(xué)位授予單位】：河北大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：TQ937

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本文編號：2683194