發(fā)布時間：2020-05-27 04:54

【摘要】：近年來,天然食源性ACE(血管緊張素轉(zhuǎn)換酶)抑制肽由于活性高,吸收好等優(yōu)點,在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景,越來越受到研究者的關(guān)注。本論文以銀杏種仁為原料,提取得到銀杏蛋白,采用堿性蛋白酶Alcalase酶解得到水解產(chǎn)物,并通過響應(yīng)面方法優(yōu)化了制備工藝,再經(jīng)過純化鑒定得到銀杏種仁ACE抑制活性肽,進一步研究了ACE活性肽對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的影響,為銀杏種仁ACE抑制肽的研究開發(fā)提供了一定的理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:1、銀杏種仁ACE抑制肽制備的工藝優(yōu)化。以水解度(DH)和多肽含量為指標(biāo),通過單因素試驗和響應(yīng)面優(yōu)化試驗得到了制備銀杏ACE抑制肽的最佳酶解工藝,其最佳條件為:酶添加量2400 U、超聲波功率118 W,超聲時間23 min,超聲溫度48℃。在此工藝條件下,多肽得率最高,為14.71%。2、三種銀杏種仁ACE抑制肽純化與鑒定。采用超濾技術(shù)將銀杏蛋白水解物進行粗分離,分為1 kDa、1-3 kDa、3-5 kDa、5-10 kDa以及銀杏蛋白總水解物GPHs五個組分,研究了分子量與體外抗氧化活性及ACE抑制活性的關(guān)系。此外,使用葡聚糖凝膠層析進一步純化后,進行LC-MS/MS鑒定,得到了3種可能的ACE抑制肽(TNLDWY、RADFY、RVFDGAV),研究了這三種ACE抑制肽的競爭模式與相互作用。結(jié)果表明,分子量小的銀杏肽其體外ACE抑制活性較高,鑒定得到的肽RVFDGAV體外ACE抑制活性最強,其IC _(50)值為1.286 mM,表現(xiàn)為競爭性抑制模式,而TNLDWY,RADFY表現(xiàn)為非競爭型抑制模式。分子模擬對接表明,三種ACE抑制肽與ACE結(jié)合良好并存在相互作用。由此,Alcalase制備得到的銀杏肽具有有效的ACE抑制活性。3、銀杏種仁ACE抑制肽的作用機理。以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(EA.Hy 926)為模型,研究銀杏種仁ACE抑制肽可能的降壓機制。通過觀察細(xì)胞活力與形態(tài),分析細(xì)胞內(nèi)的NO釋放量、ET-1分泌量以及ROS水平,并從血壓相關(guān)基因表達(dá)的層次研究抑制肽對細(xì)胞的影響。結(jié)果表明銀杏種仁ACE抑制肽可能通過增加NO釋放量,降低ET-1和ROS水平的分泌來達(dá)到降壓的目的。熒光定量PCR結(jié)果顯示細(xì)胞經(jīng)ACE抑制肽處理后,RAAS系統(tǒng)中,ACE基因的mRNA水平明顯下降,MAPK1、MAPK3、MAPK14基因的mRNA水平明顯上升,血管功能中NOSTRIN、NF-κB基因的mRNA水平明顯下降,ECE1、eNOS、JAM1、GUCY1A1、GUCY1B1基因的mRNA水平明顯上升。
【圖文】：

結(jié)果如下圖。由圖 2.1 可知，在酶添加量為 2500 U 之前解度和多肽含量逐漸增加，當(dāng)酶量達(dá)到 2500 U 時，水解度之后，繼續(xù)增加酶量對銀杏蛋白的酶解影響略有降低。由此 時，效果最好。綜上所述，選擇 2000 U、2500 U、3000的三個水平。

圖 2.2 超聲波功率對酶解銀杏蛋白的影響Fig 2.2 Effect of ultrasonic power on enzymatic hydrolysis of ginkgo p聲波時間對酶解銀杏蛋白的影響加量 2500 U、超聲功率 120 W、超聲溫度 50 ℃ 和底物濃別為 15min、20min、25min、30min 和 35min，對銀杏蛋白2.3 可知，在時間到達(dá) 25 min 之前，隨著時間的增加，水解當(dāng)時間達(dá)到 25min 時，水解度和多肽含量達(dá)到峰值，效果最間，水解度和多肽含量呈現(xiàn)出逐步下降的趨勢，分析為 25間的增大，堿性蛋白酶的活性逐漸下降，，效果逐漸變差。綜、25 min 和 30 min 作為后期響應(yīng)面實驗的三個水平。
【學(xué)位授予單位】：合肥工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TQ464

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2682985