【摘要】：2-酮基-D-葡萄糖酸(2-keto-D-gluconic acid,2KGA)是合成雜環(huán)化合物和手性化合物的骨架材料,是生產(chǎn)FDA批準(zhǔn)的食品級(jí)抗氧化劑D-異抗壞血酸的重要中間體;發(fā)酵法是目前最為經(jīng)濟(jì)、高效和環(huán)境友好的2KGA工業(yè)生產(chǎn)方法。本論文以一株糖酸轉(zhuǎn)化率高達(dá)90%,但生產(chǎn)強(qiáng)度較低的2KGA工業(yè)生產(chǎn)菌株變形假單胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)JIUM01為研究對(duì)象,通過解析其2KGA合成途徑,并鑒定其中的關(guān)鍵途徑酶、輔酶和電子傳遞途徑,在此基礎(chǔ)上,對(duì)2KGA合成途徑進(jìn)行改造,以期進(jìn)一步提高2KGA的生產(chǎn)強(qiáng)度。論文取得的主要研究結(jié)果如下:(1)解析了P.plecoglossicida JUIM01中2KGA合成途徑。采用高通量Illumina測(cè)序技術(shù)對(duì)P.plecoglossicida JUIM01進(jìn)行全基因組測(cè)序,結(jié)果顯示其染色體大小5,074,901bp,G+C含量63.6%,ORF個(gè)數(shù)4592,ORF編碼序列占總序列的87.31%,ORF平均長(zhǎng)度965 bp,87.9%的ORF得到注釋;細(xì)胞內(nèi)不含質(zhì)粒。P.plecoglossicida JUIM01在基因組上顯示了區(qū)別于假單胞菌屬模式菌株的獨(dú)特性,屬于從Pseudomonas putida種中獨(dú)立出來的一個(gè)新種——P.plecoglossicida。通過比較基因組學(xué)分析,挖掘了葡萄糖代謝途徑、2KGA合成途徑、輔酶PQQ合成途徑以及電子傳遞途徑的相關(guān)基因,繪制了這些途徑相關(guān)基因簇的基本結(jié)構(gòu),推斷了2KGA合成途徑。(2)鑒定了P.plecoglossicida JUIM01中2KGA合成途徑的關(guān)鍵酶。對(duì)P.plecoglossicida JUIM01的膜結(jié)合葡萄糖脫氫酶(mGDH)進(jìn)行分離純化、酶學(xué)特性表征等研究,結(jié)果表明,野生mGDH為單亞基,分子量約為87 kDa;比酶活為16.85 U/mg;底物譜相對(duì)較寬(5種),最適底物為D-葡萄糖,K_m和V_(max)值分別為0.042 mM和14.620μM/min;最適pH 6.0,最適溫度35°C,耐酸,熱穩(wěn)定性相對(duì)較差(55°C下2 h酶活完全喪失),Ca~(2+)/Mg~(2+)顯著促進(jìn)其酶活,EDTA/EGTA顯著抑制其酶活。對(duì)mGDH的編碼基因gcd進(jìn)行敲除和回補(bǔ),結(jié)果表明,敲除gcd阻斷了2KGA合成,細(xì)胞生長(zhǎng)速率降低19%;通過在大腸桿菌中異源表達(dá)mGDH,進(jìn)一步驗(yàn)證mGDH在2KGA合成中的作用。采用同樣的方法,鑒定了膜結(jié)合葡萄糖酸脫氫酶(mGADH),結(jié)果表明,野生mGADH比酶活90.71 U/mg;由分子量約為27 kDa的γ亞基、65 kDa的黃素蛋白亞基和47 kDa的細(xì)胞色素c亞基共3個(gè)亞基組成,黃素蛋白和細(xì)胞色素c亞基分別含有1個(gè)假定的FAD結(jié)合基序和3個(gè)可能的血紅素結(jié)合基序(C-X-X-C-H);該酶對(duì)D-葡萄糖酸具有嚴(yán)格的底物特異性,K_m和V_(max)值分別為0.631 mM和0.734 mM/min;最適pH 6.0,最適溫度35°C,有較好的耐酸性和熱穩(wěn)定性,Ca~(2+)和Mn~(2+)可促進(jìn)其酶活提高;進(jìn)一步通過異源表達(dá)mGADH,證實(shí)其在2KGA合成中的作用。(3)解析了P.plecoglossicida JUIM01的電子傳遞途徑和輔酶吡咯喹啉醌(PQQ)合成途徑。通過電子傳遞鏈的生化抑制方法,明確電子傳遞鏈的末端氧化酶種類為Cyo氧化酶、CIO氧化酶以及3種細(xì)胞色素c氧化酶,初步確定P.plecoglossicida JUIM01催化氧化葡萄糖時(shí)的電子傳遞鏈系統(tǒng)的組成為:PQQ-mGDH、泛醌以及5種末端氧化酶,其中2個(gè)對(duì)苯二酚氧化酶(CIO氧化酶和Cyo氧化酶)發(fā)揮主要作用。進(jìn)一步對(duì)相關(guān)基因簇中的各基因分別進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平分析和生物信息學(xué)分析,確定了pqq操縱子的基因組成包括pqqF、pqqA、pqqB、pqqC、pqqD、pqqE、pqqM、pqqH,以及位于反向互補(bǔ)鏈上的pqqI;非編碼序列中存在6個(gè)啟動(dòng)子區(qū)、7個(gè)終止子區(qū)和6個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn);pqqF獨(dú)立轉(zhuǎn)錄,pqqF具有一個(gè)獨(dú)立的啟動(dòng)子和終止子,pqqC、pqqD、pqqE、pqqM這4個(gè)基因同屬于一個(gè)轉(zhuǎn)錄單元,pqqM和pqqH則不屬于同一個(gè)轉(zhuǎn)錄單元;pqqF、pqqA和pqqB與gcd的表達(dá)量正相關(guān),其中pqqF與P.plecoglossicida JUIM01發(fā)酵產(chǎn)2KGA的相關(guān)性最大,可作為改造P.plecoglossicida JUIM01提高2KGA生產(chǎn)強(qiáng)度的潛在靶點(diǎn)。(4)改造P.plecoglossicida JUIM01生產(chǎn)2KGA。構(gòu)建增強(qiáng)表達(dá)2KGA合成途徑的兩個(gè)關(guān)鍵酶mGDH和mGADH的工程菌,當(dāng)采用20 g/L葡萄糖為底物,在500 mL搖瓶中,重組菌P.plecoglossicida JUIM01/pBBR1MCS-2-gcd-gad的gcd基因表達(dá)量提高3.21倍,總酶活提高36%;gad(編碼mGADH)基因表達(dá)量和總酶活均提高5.66倍,葡萄糖消耗速率和2KGA生產(chǎn)強(qiáng)度均提高25%;當(dāng)采用140 g/L葡萄糖為底物,在30 L發(fā)酵罐規(guī)模上,葡萄糖消耗速率提高23.1%,2KGA生產(chǎn)強(qiáng)度提高34%。通過輔酶改造解決PQQ供應(yīng)不足問題,進(jìn)一步提高了2KGA生產(chǎn)強(qiáng)度,在140 g/L葡萄糖起始濃度的30 L發(fā)酵罐中,重組菌P.plecoglossicida JUIM01/pBBR1MCS-2-gcd-gad-pqqF的葡萄糖消耗速率和2KGA生產(chǎn)強(qiáng)度比改造前的菌株分別提高21.28%和21.41%;比出發(fā)菌P.plecoglossicida JUIM01分別提高61.23%和62.61%。
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第一章 緒論第一章 緒論酸的理化性質(zhì)與用途（2-keto-D-gluconic acid，簡(jiǎn)稱 2KGA），Ketogluconicacid、2-Dehydro-D-gluconate、acid、α-D-arabino-2-Hexulosonic acid；其它戊二酸、D-阿拉伯-2-己糖醛酸；分子式：C子質(zhì)量：194.1394；CAS 登錄號(hào)：669-90征：白色粉末狀晶體，無臭；具有較強(qiáng)吸醇，不溶于絕大多數(shù)有機(jī)溶劑。

圖 1-2 推測(cè)的假單胞菌葡萄糖代謝途徑Fig. 1-2 The presumed pathway of glucose metabolism in Pseudomonas注：OM：細(xì)胞外膜；PS：周質(zhì)空間；IM：細(xì)胞內(nèi)膜。值得一提的是，2015 年 Umezawa 等[5]對(duì)目前公認(rèn)的以上假單胞菌 2KGA 合成途徑提出了挑戰(zhàn)，他們首次在 Pseudomonasaureofaciens 中發(fā)現(xiàn)了可催化 2-酮基-D-葡萄糖為2KGA 的 2-酮基-D-葡萄糖脫氫酶（2-keto-D-glucose dehydrogenase）編碼基因，提\，

本文編號(hào)：2680195