【摘要】：化學(xué)精煉植物油的目的是為了除去會對成品油的質(zhì)量和保質(zhì)期造成不良影響的雜質(zhì)。然而,考慮到對環(huán)境的影響和經(jīng)濟效益,物理精煉方法的使用正在增加。酶促脫膠則是一種能夠達(dá)到物理精煉油要求的脫膠方法,但磷脂酶的生產(chǎn)高成本和低效率局限了其應(yīng)用。同時,用于脫膠的磷脂酶不能被回收和再次利用也大大提高了酶法脫膠的工業(yè)化應(yīng)用成本。本研究克隆外膜磷脂酶A1基因,構(gòu)建原核和真核表達(dá)載體,實現(xiàn)其在原核和真核表達(dá)體系中的異源表達(dá),研究了其酶學(xué)特性與固定化過程,并將其應(yīng)用于粗菜籽油的酶法脫膠中,為開發(fā)新型磷脂酶和改進(jìn)脫膠技術(shù)提出了一種有效可行的方法,主要結(jié)果如下:(1)外膜磷脂酶A1基因克隆及生物信息學(xué)分析。將粘質(zhì)沙雷氏菌總基因組當(dāng)模板,PCR擴增得到目的基因,構(gòu)建pEASY-OM-PLA1,轉(zhuǎn)入E.coil DH5α,抽取質(zhì)粒測序驗證并分析。該基因與Serratia marcescens subsp.marcescens Db11同源性為99.55%。進(jìn)化樹結(jié)果顯示,該基因所產(chǎn)OM-PLA1與來源于大腸桿菌NC_000913.3的OM-PLA1表現(xiàn)出最高的同源性。該蛋白分子式為C_(1513)H_(2249)N_(411)O_(449)S_6,相對分子質(zhì)量為33572.34,是穩(wěn)定親水性蛋白,含有信號肽,為胞外分泌蛋白,蛋白二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋占15.75%,β-折疊占36.64%,無規(guī)則卷曲占47.60%且不含有非常規(guī)二級結(jié)構(gòu),三級結(jié)構(gòu)顯示每個單體為β-桶狀結(jié)構(gòu)。(2)重組大腸桿菌構(gòu)建、酶學(xué)特性及酶法脫膠。將pEASY-OM-PLA1轉(zhuǎn)入E.coil BL21(DE3)中,外膜磷脂酶A1的活性在誘導(dǎo)4 h和IPTG濃度0.6 mmol/L的條件下最大化。重組蛋白經(jīng)Ni~(2+)柱純化后SDS-PAGE檢測顯示,有一分子量約為33 KDa的特異性條帶。酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果顯示,其最適pH和最適溫度分別為7.5和50℃,在pH 7.0-8.0和45-55℃內(nèi)其穩(wěn)定性較好,酶動力學(xué)參數(shù)為Km=31.954mM,Vmax=1.5056 mM/min,0.1 mmol/L的Ca~(2+)、Mg~(2+)、Co~(2+)、Mn~(2+)溶液能顯著提高其酶活力,1 mmol/L的Cu~(2+)、Zn~(2+)、SDS、EDTA、EGTA溶液則顯著抑制了其酶活力。用于粗菜籽油脫膠,當(dāng)酶添加量為15 U和脫膠時間為2 h時,脫膠油樣中的磷含量值均從22.6 mg/kg降低至10 mg/kg以下。(3)重組畢赤酵母構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)�；蛏舷掠吻度朊盖形稽c后,通過雙酶切及T_4連接酶過夜連接的方法,構(gòu)建出pPIC9K-His-OM-PLA1,將其導(dǎo)入畢赤酵母GS115中。結(jié)果顯示,重組畢赤酵母為His+Muts表型即甲醇緩慢利用型,基因組DNA經(jīng)凝膠電泳檢測顯示具有大小約為900bp的單一條帶。在誘導(dǎo)72 h后,酶活到達(dá)最大為3.21 U/mL,目的蛋白經(jīng)Ni~(2+)柱純化和超濾管濃縮后,SDS顯示特定的蛋白質(zhì)條帶,其分子量約為33 KDa,且酶活最大達(dá)到21.2 U/mL。分別在初始轉(zhuǎn)接量為50 mL、溫度為28℃和甲醇濃度為1%時,重組畢赤酵母分泌表達(dá)的OM-PLA1酶活較高。(4)外膜磷脂酶A1的固定化及酶法脫膠。采取水熱共沉淀法制備了載體Fe_3O_4/氧化石墨烯,成功制備出載體材料后通過加入戊二醛將重組畢赤酵母分泌表達(dá)的外膜磷脂酶A1固定在載體材料上。最佳固定化條件是緩沖液pH為6、戊二醛的濃度為7%和固定化時間為3 h。制備出來的固定化外膜磷脂酶A1最適pH為7.5、最適溫度為50℃,在4℃環(huán)境下保存近3個月后還留有58.9%的原始酶活力。將其用于粗菜籽油的酶法脫膠,pH 7.5、反應(yīng)時間2.5 h、反應(yīng)溫度50℃是最佳脫膠條件,固定化外膜磷脂酶A1循環(huán)脫膠13次后,還具有初始酶活力的51.7%。
【圖文】：

同而存在有差異，以此為依據(jù)可以將其主要分為兩大酶。�；饷钢写笾路譃榱字� A1、磷脂酶 A2 及甘油磷脂的 sn-1 位�；�、sn-2 位酰基及同時作用 sn-1用于-3 位酯鍵的是磷酸二酯酶，包括磷脂酶 C 和磷結(jié)構(gòu)通式及各類磷脂酶水解時的作用位點如圖 1.1 所脂酶主要以分泌型、膜結(jié)合型和胞內(nèi)型等形式存在[2]有多種磷脂酶。其生物功能主要可以分為三大類：調(diào)；對細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的維持和修復(fù)；體內(nèi)磷脂的水解[3]。品中都含有磷脂且對其中的磷脂進(jìn)行改性后能夠適在食品工業(yè)應(yīng)用中占有重要地位。在食品加工過程中節(jié)約能源、提高效率、改善性能或提高最終產(chǎn)品質(zhì)量含的磷脂成分作用產(chǎn)生乳化劑樣分子（例如溶血卵磷例如，，烘焙行業(yè)和蛋黃行業(yè)[4]中的磷脂酶應(yīng)用。磷脂酶，植物粗油中的磷脂雜質(zhì)在磷脂酶的作用下被除去，從

圖 1.2 外膜磷脂酶 A 二聚體結(jié)構(gòu).2 The structure of outer membrane phospholipase Adim 的催化機制 被歸類于脂肪酶之中，但其序列和水溶性脂肪酶著的序列同源性且外膜磷脂酶 A 中不含有半胱氨脂酶 A 酶活性有重要意義的氨基酸殘基就變得十知[23-24]，Ser-152 在穩(wěn)定外膜磷脂酶 A 活性二聚體為其活性位點氨基酸，因 His 殘基可以作為激 OM-PLA 酶活性中 His-142 的影響也是不可或缺 的激活機制 的體內(nèi)激活模式如圖 1.3 所示[22]。在正常生長的存在于細(xì)胞外膜中，此時處于自然休眠狀態(tài)。而誘導(dǎo)發(fā)生破裂時，細(xì)胞外膜的完整性被破壞，此時
【學(xué)位授予單位】：合肥工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TS225.14;Q814

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2675078