【摘要】：化學精煉植物油的目的是為了除去會對成品油的質(zhì)量和保質(zhì)期造成不良影響的雜質(zhì)。然而,考慮到對環(huán)境的影響和經(jīng)濟效益,物理精煉方法的使用正在增加。酶促脫膠則是一種能夠達到物理精煉油要求的脫膠方法,但磷脂酶的生產(chǎn)高成本和低效率局限了其應用。同時,用于脫膠的磷脂酶不能被回收和再次利用也大大提高了酶法脫膠的工業(yè)化應用成本。本研究克隆外膜磷脂酶A1基因,構建原核和真核表達載體,實現(xiàn)其在原核和真核表達體系中的異源表達,研究了其酶學特性與固定化過程,并將其應用于粗菜籽油的酶法脫膠中,為開發(fā)新型磷脂酶和改進脫膠技術提出了一種有效可行的方法,主要結果如下:(1)外膜磷脂酶A1基因克隆及生物信息學分析。將粘質(zhì)沙雷氏菌總基因組當模板,PCR擴增得到目的基因,構建pEASY-OM-PLA1,轉(zhuǎn)入E.coil DH5α,抽取質(zhì)粒測序驗證并分析。該基因與Serratia marcescens subsp.marcescens Db11同源性為99.55%。進化樹結果顯示,該基因所產(chǎn)OM-PLA1與來源于大腸桿菌NC_000913.3的OM-PLA1表現(xiàn)出最高的同源性。該蛋白分子式為C_(1513)H_(2249)N_(411)O_(449)S_6,相對分子質(zhì)量為33572.34,是穩(wěn)定親水性蛋白,含有信號肽,為胞外分泌蛋白,蛋白二級結構中α-螺旋占15.75%,β-折疊占36.64%,無規(guī)則卷曲占47.60%且不含有非常規(guī)二級結構,三級結構顯示每個單體為β-桶狀結構。(2)重組大腸桿菌構建、酶學特性及酶法脫膠。將pEASY-OM-PLA1轉(zhuǎn)入E.coil BL21(DE3)中,外膜磷脂酶A1的活性在誘導4 h和IPTG濃度0.6 mmol/L的條件下最大化。重組蛋白經(jīng)Ni~(2+)柱純化后SDS-PAGE檢測顯示,有一分子量約為33 KDa的特異性條帶。酶學性質(zhì)研究結果顯示,其最適pH和最適溫度分別為7.5和50℃,在pH 7.0-8.0和45-55℃內(nèi)其穩(wěn)定性較好,酶動力學參數(shù)為Km=31.954mM,Vmax=1.5056 mM/min,0.1 mmol/L的Ca~(2+)、Mg~(2+)、Co~(2+)、Mn~(2+)溶液能顯著提高其酶活力,1 mmol/L的Cu~(2+)、Zn~(2+)、SDS、EDTA、EGTA溶液則顯著抑制了其酶活力。用于粗菜籽油脫膠,當酶添加量為15 U和脫膠時間為2 h時,脫膠油樣中的磷含量值均從22.6 mg/kg降低至10 mg/kg以下。(3)重組畢赤酵母構建及誘導表達�；蛏舷掠吻度朊盖形稽c后,通過雙酶切及T_4連接酶過夜連接的方法,構建出pPIC9K-His-OM-PLA1,將其導入畢赤酵母GS115中。結果顯示,重組畢赤酵母為His+Muts表型即甲醇緩慢利用型,基因組DNA經(jīng)凝膠電泳檢測顯示具有大小約為900bp的單一條帶。在誘導72 h后,酶活到達最大為3.21 U/mL,目的蛋白經(jīng)Ni~(2+)柱純化和超濾管濃縮后,SDS顯示特定的蛋白質(zhì)條帶,其分子量約為33 KDa,且酶活最大達到21.2 U/mL。分別在初始轉(zhuǎn)接量為50 mL、溫度為28℃和甲醇濃度為1%時,重組畢赤酵母分泌表達的OM-PLA1酶活較高。(4)外膜磷脂酶A1的固定化及酶法脫膠。采取水熱共沉淀法制備了載體Fe_3O_4/氧化石墨烯,成功制備出載體材料后通過加入戊二醛將重組畢赤酵母分泌表達的外膜磷脂酶A1固定在載體材料上。最佳固定化條件是緩沖液pH為6、戊二醛的濃度為7%和固定化時間為3 h。制備出來的固定化外膜磷脂酶A1最適pH為7.5、最適溫度為50℃,在4℃環(huán)境下保存近3個月后還留有58.9%的原始酶活力。將其用于粗菜籽油的酶法脫膠,pH 7.5、反應時間2.5 h、反應溫度50℃是最佳脫膠條件,固定化外膜磷脂酶A1循環(huán)脫膠13次后,還具有初始酶活力的51.7%。
【圖文】：

同而存在有差異，以此為依據(jù)可以將其主要分為兩大酶。�；饷钢写笾路譃榱字� A1、磷脂酶 A2 及甘油磷脂的 sn-1 位酰基、sn-2 位�；巴瑫r作用 sn-1用于-3 位酯鍵的是磷酸二酯酶，包括磷脂酶 C 和磷結構通式及各類磷脂酶水解時的作用位點如圖 1.1 所脂酶主要以分泌型、膜結合型和胞內(nèi)型等形式存在[2]有多種磷脂酶。其生物功能主要可以分為三大類：調(diào)；對細胞膜結構的維持和修復；體內(nèi)磷脂的水解[3]。品中都含有磷脂且對其中的磷脂進行改性后能夠適在食品工業(yè)應用中占有重要地位。在食品加工過程中節(jié)約能源、提高效率、改善性能或提高最終產(chǎn)品質(zhì)量含的磷脂成分作用產(chǎn)生乳化劑樣分子（例如溶血卵磷例如，，烘焙行業(yè)和蛋黃行業(yè)[4]中的磷脂酶應用。磷脂酶，植物粗油中的磷脂雜質(zhì)在磷脂酶的作用下被除去，從

圖 1.2 外膜磷脂酶 A 二聚體結構.2 The structure of outer membrane phospholipase Adim 的催化機制 被歸類于脂肪酶之中，但其序列和水溶性脂肪酶著的序列同源性且外膜磷脂酶 A 中不含有半胱氨脂酶 A 酶活性有重要意義的氨基酸殘基就變得十知[23-24]，Ser-152 在穩(wěn)定外膜磷脂酶 A 活性二聚體為其活性位點氨基酸，因 His 殘基可以作為激 OM-PLA 酶活性中 His-142 的影響也是不可或缺 的激活機制 的體內(nèi)激活模式如圖 1.3 所示[22]。在正常生長的存在于細胞外膜中，此時處于自然休眠狀態(tài)。而誘導發(fā)生破裂時，細胞外膜的完整性被破壞，此時
【學位授予單位】：合肥工業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：TS225.14;Q814

【參考文獻】

相關期刊論文 前7條

1 呂素芳;劉崢;郭廣君;蔡永萍;邱德文;;大腸桿菌中表達外源重組蛋白的研究[J];科學技術與工程;2006年18期

2 劉忠淵,張富春,毛新芳,王蕓;利用畢赤酵母表達外源蛋白的研究[J];生物技術;2004年01期

3 韓雪清,劉湘濤,尹雙輝;畢赤酵母表達系統(tǒng)[J];微生物學雜志;2003年04期

4 劉春葉,王亞明,唐輝;酶的固定化及化學修飾[J];云南化工;2002年05期

5 黃雅欽,冷延國,黃明智;AS1.398中性蛋白酶制備水解明膠(Ⅱ)——酶的固定化研究[J];化學工業(yè)與工程;2001年02期

6 隋廣超，胡美浩;影響大腸桿菌中外源基因表達的因素[J];生物化學與生物物理進展;1994年02期

7 陳安和;;酶化學修飾在酶工程中的應用[J];渝州大學學報(自然科學版);1992年02期

相關博士學位論文 前1條

1 郭雨剛;畢赤酵母表達系統(tǒng)及其應用[D];中國科學技術大學;2012年

相關碩士學位論文 前4條

1 王薛婷;重組磷脂酶C的制備、酶學性質(zhì)及其mPEG修飾初探[D];集美大學;2016年

2 呂妍;磷脂酶C在枯草芽胞桿菌中的表達與定向進化[D];浙江大學;2015年

3 楊治彪;磷脂酶D制備及催化合成磷脂酰絲氨酸工藝研究[D];西北大學;2008年

4 王蕓;重組畢赤酵母高密度發(fā)酵生產(chǎn)堿性果膠酶的策略研究[D];江南大學;2008年

本文編號：2675078