【摘要】：隨著化石資源的日益緊缺,微生物油脂作為新興的可再生能源,受到研究者的極大關(guān)注。而其中產(chǎn)油酵母菌具有生長速度快,能積累較多生物量,油脂含量高等優(yōu)點(diǎn),應(yīng)用前景廣泛。但是對于產(chǎn)油酵母油脂代謝過程中不飽和脂肪酸合成的關(guān)鍵基因—脂肪酸脫氫酶對油脂合成的作用尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)在解脂亞羅酵母(Yarrowia lipolytica)中過量表達(dá)SCD對細(xì)胞生長和油脂含量有顯著作用。而Y.lipolytica脂肪酸代謝途徑還有其他的脫氫酶,那么SCD到底是一個專一性的脫氫酶,還是一類脫氫酶都有相同的一個作用—提高油脂的含量,還需要繼續(xù)進(jìn)行探索。本研究通過結(jié)合油脂酵母三個方面的遺傳改造,構(gòu)建高產(chǎn)油脂酵母菌株YL-AD10;在此基礎(chǔ)上探究脂肪酸脫氫酶(SCD,12D,15D)在油脂合成中的關(guān)鍵作用;考察構(gòu)建的工程菌株(YL-12D15DA)在5L發(fā)酵罐內(nèi)的生長及產(chǎn)油情況,為實現(xiàn)工業(yè)化培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。本課題主要研究結(jié)果如下:(1)基于同源重組原理,分別敲除Y.lipolytica polf的pex10,mfe基因阻斷油脂的降解途徑,研究發(fā)現(xiàn)pex10-的菌株比mfe-菌株胞內(nèi)油脂含量積累更多,相比原始菌株的油脂含量增加了1倍,而且對菌體的生長的抑制作用相對較小;在pex10-的菌株過量表達(dá)DGA1,油脂含量明顯增加,比pex10-菌株的油脂含量增加47%,而且過量表達(dá)DGA1,脂肪酸組成基本保持不變;以pex10-,DGA1+為背景菌株,過量表達(dá)ACC1得到的菌株YL-AD10,油脂含量達(dá)到29.78%DCW,比對照菌株(DGA1+,pex10-)增加了 32%,脂肪酸組成成分變化不大。(2)在YL-AD10(pex10-,DGA1+,ACC1+)菌株中分別表達(dá)SCD,Δ12D和Δ15D(外源),結(jié)果表明這三個脫氫酶的過量表達(dá)都可以使菌體胞內(nèi)油脂含量增加。過量表達(dá)Δ15D油脂含量增加最多,達(dá)到37.56%,而且亞油酸(LA)占總脂肪酸的含量從18.2%到23.6%,而油酸(OA)的含量有所下降。增加脂肪酸脫氫酶的拷貝數(shù),油脂含量相應(yīng)增加,其中過量表達(dá)12D-15D(YL-12D15DA)油脂含量最高,達(dá)到48.7%,比對照菌株YL-AD10提高了 63%。(3)在5L發(fā)酵罐對對照菌株polf和重組菌株YL-12D15DA進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),在穩(wěn)定期110 h后,細(xì)胞油脂含量達(dá)到最高,分別達(dá)到7.7%和33.7%DCW;熒光顯微鏡的圖片顯示出在對數(shù)期(72 h)部分polf的細(xì)胞呈現(xiàn)菌絲狀,胞內(nèi)有較小的清晰可見的油滴;菌株YL-12D15DA的細(xì)胞大部分呈現(xiàn)橢圓形,胞內(nèi)油脂含量大約達(dá)到細(xì)胞體積的3/4。本研究通過結(jié)合油脂酵母三個方面的遺傳改造,構(gòu)建了高產(chǎn)油脂菌株YL-AD10(pex10-,DGA1+,ACC1+);在此基礎(chǔ)上研究發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)脂肪酸脫氫酶(12D,15D,SCD)可以顯著提高油脂產(chǎn)量;而且同時表達(dá)12D-15D,得到的菌株YL-12D 15DA胞內(nèi)油脂含量最高。這些為更好了解油脂代謝途徑以及實現(xiàn)微生物油脂的工業(yè)化奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

１．３微生物油脂合成機(jī)制逡逑微生物合成油脂是由乙酰輔酶Ａ邋（ａｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ）的羧化反應(yīng)開始，然后經(jīng)過多逡逑次鏈的延長和去飽和作用形成各種脂肪酸，最后形成三酰甘油［５，５１］。圖１－１是酵逡逑６逡逑

圖２－１酵母中敲除基因及ｍａｒｋｅｒ去除途徑逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋Ｐａｔｈｗａｙ邋ｏｆ邋ｋｎｏｃｋ邋ｏｕｔ邋ｏｆ邋ｇｅｎｅ邋ａｎｄ邋ｍａｒｋｅｒ邋ｒｅｍｏｖｅ邋ｉｎ邋ｙｅａｓｔ逡逑２．３．８酵母細(xì)胞生長的測定逡逑（１）邐00＿值的測定：逡逑取發(fā)酵培養(yǎng)液１邋ｍＬ邋，選擇合適的稀釋度，用紫外分光光度計測定吸光值。逡逑（２）細(xì)胞干重的測定：逡逑�。担板澹恚痰陌l(fā)酵液，４０００ｘｇ，離心１0邋ｍｉｎ，棄上清，，收集菌體沉淀。去離逡逑子水清洗細(xì)胞２次，于１０５邋°Ｃ烘干至恒重，計算出每毫升發(fā)酵液的細(xì)胞干重，逡逑以ｍｇ／ｍＬ表示。然后利用細(xì)胞干重與ＯＤ值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，細(xì)胞生長是通過測逡逑定發(fā)酵液的0Ｄ＿獲得。逡逑２．３．９月旨肪酸成分分析逡逑２．３．９．１脂肪酸甲酯化逡逑
【學(xué)位授予單位】：陜西師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：TE667

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2675071