【摘要】：白蛋白約占血漿總蛋白的50%以上,是目前臨床應用最為廣泛的藥用蛋白。白蛋白標準物質(zhì)的研制對于產(chǎn)品的質(zhì)控和相關分析方法的評價建立具有重要的意義。本研究建立了人血漿及人尿來源的高純白蛋白純化工藝,并在最優(yōu)條件下實現(xiàn)了工藝放大研究,用于人源白蛋白標準物質(zhì)原料的純化制備。建立了基于氨基酸水解-同位素稀釋質(zhì)譜法的蛋白定量方法,用于對高純白蛋白產(chǎn)品的定值研究。實驗首先建立了冷乙醇沉淀-兩步色譜層析技術,從人血漿純化白蛋白(human serum albumin,HSA)的工藝。人血漿經(jīng)過離心后,冷乙醇沉淀除去免疫球蛋白、纖維蛋白原等大部分雜蛋白�；贖SA的等電點及分子結構與雜蛋白的性質(zhì)差異,確定了陽-陰雙離子交換層析的純化方案。實驗優(yōu)化了陽離子交換層析參數(shù),確定了pH6.0,介質(zhì)CM Sepharose FF,穿透模式的層析條件。考察了在陰離子交換層析中不同緩沖液條件下的層析效果,確定醋酸鹽作為緩沖體系,pH5.2上樣、pH4.6洗脫的pH梯度洗脫模式。在最優(yōu)層析條件下進行了HSA純化工藝的放大研究,產(chǎn)品純度在99.0%以上。此外,實驗建立了一步凝膠過濾層析技術,純化制備人尿來源白蛋白高純品,實現(xiàn)了雜質(zhì)與主成分的有效分離,產(chǎn)品純度達到了99.0%以上。在蛋白定值方面,建立了基于氨基酸水解-同位素稀釋質(zhì)譜法的蛋白定量方法,對白蛋白高純產(chǎn)品純度定值,并進行了表征。圓二色光譜鑒定白蛋白的二級結構;凝膠過濾高效液相色譜(HPSEC)檢測白蛋白的結構完整性及可能的聚集體雜質(zhì);質(zhì)譜檢測分子量為66546 Da。以國際比對實驗CCQM-K78為基礎,將蛋白樣品酸解為氨基酸,通過測量水解液中苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸四種氨基酸的含量計算蛋白含量。方法進行了色譜條件優(yōu)化,實現(xiàn)了亮氨酸和異亮氨酸同分異構體的分離,并完成了方法學驗證,分別評價了方法的重復性、再現(xiàn)性、準確度、定量限和檢測限。建立的同位素稀釋質(zhì)譜法具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、準確性高、操作簡單的優(yōu)點,且定量結果可以溯源到SI單位,可作為蛋白純度標準物質(zhì)的定值方法之一,為后續(xù)蛋白含量準確測定工作奠定了基礎。
【圖文】：

中：x，Pstd 分表代表待測物和內(nèi)標標準物質(zhì)的純度；、Nx、Mx、mx分別代表待測物之的響應峰面積、定量峰對應的原子數(shù)目質(zhì)量；td、Nstd、Mstd、mstd分別代表選定內(nèi)標準物質(zhì)的響應峰面積、定量峰對應摩爾質(zhì)量、質(zhì)量。蛋白質(zhì)控品研制現(xiàn)狀準物質(zhì)是測試分析的技術保障，，也是科學研究、方法研究和評價、質(zhì)量制、量值傳遞和量值溯源的基礎[11-13]。蛋白是目前臨床上應用最廣的藥用蛋白。根據(jù)相關市場調(diào)研[14](圖 1-1)，4 年，人血白蛋白的批簽發(fā)量呈穩(wěn)步增長的趨勢，國產(chǎn)及進口數(shù)量均有增國產(chǎn)數(shù)量有限，市場需求缺口較大，依靠進口人血白蛋白補充，進口產(chǎn)為迅速，由 47.87%增加到 58.49%。由于我國人口眾多以及醫(yī)療水平的提床需求只增不減。這也就意味著，在現(xiàn)有血漿資源緊缺的情況下，提高白純化工藝的純度和收率均具有重要的意義。

4圖 1-3 Kistler-Nitschmann 法分離白蛋白的工藝例子 Typical example of separation of albumin by Kistler-Nitschma用最廣泛的蛋白質(zhì)分離純化技術[19]，目前 95%以上的。譜(ion exchange chromatography，IEC)是蛋白質(zhì)分離純利用被分離組分與固定相之間發(fā)生離子交換的能力定相一般為離子交換樹脂，樹脂分子結構中存在許
【學位授予單位】：天津理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：TQ936.2;TQ421.31

【參考文獻】

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