【摘要】：抗體作為臨床應(yīng)用最廣泛的治療性蛋白藥物,主要是通過(guò)CHO(Chinese Hamster Ovary)細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)表達(dá)生產(chǎn)。與前一代的生物技術(shù)產(chǎn)品如細(xì)胞因子類(lèi)藥物相比,抗體類(lèi)生物藥的主要特點(diǎn)是臨床用藥劑量大,因此需要大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)來(lái)滿足市場(chǎng)需求,而CHO細(xì)胞培養(yǎng)的工藝優(yōu)化和規(guī)模放大具有較大挑戰(zhàn)性。提高細(xì)胞培養(yǎng)工藝表達(dá)量,擴(kuò)大細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)規(guī)模,保證表達(dá)抗體質(zhì)量穩(wěn)定成為目前國(guó)內(nèi)抗體產(chǎn)業(yè)界在抗體類(lèi)蛋白藥物規(guī)模生產(chǎn)過(guò)程中亟待解決的問(wèn)題。本文圍繞著以上問(wèn)題,系統(tǒng)研究了CHO細(xì)胞的流加培養(yǎng)小試工藝優(yōu)化,中試和產(chǎn)業(yè)化規(guī)模工藝放大,并探索性開(kāi)發(fā)了基于切向流換液(ATF)技術(shù)的濃縮灌流工藝,以進(jìn)一步提升我國(guó)抗體類(lèi)藥物規(guī)模產(chǎn)能。首先考察了培養(yǎng)基中金屬離子的濃度對(duì)抗體質(zhì)量的影響,培養(yǎng)基中將銅離子濃度從1000 nM降低到500 nM時(shí),抗體產(chǎn)物MAb A的生產(chǎn)細(xì)胞可以維持1.2×107 vc/mL密度的生長(zhǎng),抗體產(chǎn)量保持不變,電荷異構(gòu)體中堿性異構(gòu)體的比例明顯降低。說(shuō)明銅離子作為多種酶的輔因子,除了維持細(xì)胞生長(zhǎng)代謝,還會(huì)對(duì)C-端脯氨酸酰胺化產(chǎn)生影響。在攪拌式反應(yīng)器培養(yǎng)抗體MAb A生產(chǎn)細(xì)胞時(shí),將溶氧從60%降低至20%,細(xì)胞生長(zhǎng)及抗體產(chǎn)量沒(méi)有明顯變化,抗體N-糖基化中G0F 比例明顯升高,G1F 比例明顯降低,說(shuō)明溶氧水平對(duì)半乳糖糖基化有明顯影響。另一方面延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間觀察到抗體酸性異構(gòu)體比例明顯上升,主要原因是培養(yǎng)液環(huán)境中自由基和氧化還原作用對(duì)抗體理化性質(zhì)的穩(wěn)定性存在一定影響。隨后基于機(jī)械攪拌鼓泡式反應(yīng)器內(nèi)氣-液傳質(zhì)理論,開(kāi)發(fā)了一套動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器傳質(zhì)模型。此模型結(jié)合了反應(yīng)器傳質(zhì)屬性和細(xì)胞培養(yǎng)代謝參數(shù)對(duì)細(xì)胞在大規(guī)模反應(yīng)器培養(yǎng)過(guò)程中的氧氣需求和二氧化碳累積水平做出了預(yù)測(cè)。在此模型的指導(dǎo)下,MAb A細(xì)胞培養(yǎng)工藝從2L實(shí)驗(yàn)室規(guī)模一次性放大到了1500L產(chǎn)業(yè)化規(guī)模,最終細(xì)胞生長(zhǎng)、抗體產(chǎn)量和抗體質(zhì)量在小試規(guī)模和商業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模之間保持了一致。針對(duì)傳統(tǒng)CHO細(xì)胞流加培養(yǎng)條件下由于細(xì)胞代謝廢物積累造成抗體產(chǎn)量難以進(jìn)一步大幅提高的問(wèn)題,我們開(kāi)發(fā)了基于切向流過(guò)濾換液ATF系統(tǒng)的CHO細(xì)胞濃縮灌流培養(yǎng)工藝。在濃縮灌流培養(yǎng)工藝的優(yōu)化過(guò)程中,培養(yǎng)液中游離氨基酸濃度的檢測(cè)起了很重要的作用,為灌流培養(yǎng)基配方的優(yōu)化及灌流速率的調(diào)整提供了依據(jù)。最終通過(guò)濃縮灌流培養(yǎng)工藝,MAb A細(xì)胞生長(zhǎng)密度提高了7.5倍,抗體產(chǎn)量提高了7.7倍。
【圖文】：

制藥總銷(xiāo)售額（不包括疫苗）的近６６％。逡逑２０１８年十大最暢銷(xiāo)的生物制藥包括八種抗體（六種單克隆抗體和兩種逡逑基于Ｆｃ的融合蛋白）（圖１．２）。用于治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和相關(guān)疾病的逡逑ＴＮＦ－ａ抑制劑，第一個(gè)單克隆抗體阿達(dá)木單克隆抗體（商品名Ｈｕｍｉｒａ）在逡逑此榜單中名列第一，，創(chuàng)造了邋１９９．３６億美元的收入。逡逑４逡逑

Ｆｉｇｕｒｅ邋１．２邋Ｔｏｐ邋１０邋ｇｌｏｂａｌ邋ｓａｌｅｓ邋ｏｆ邋ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ逡逑１．１．３國(guó)內(nèi)抗體規(guī)模生產(chǎn)逡逑隨著國(guó)家在生命科學(xué)和生物醫(yī)藥領(lǐng)域的大力投入，我國(guó)在生物新藥創(chuàng)制的上逡逑游領(lǐng)域己經(jīng)逐漸和國(guó)際接軌并形成了自己的技術(shù)特色。在抗體和融合蛋白領(lǐng)域，逡逑國(guó)內(nèi)很多實(shí)驗(yàn)室己經(jīng)積累了一批具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的創(chuàng)新藥和改進(jìn)藥。但是如何逡逑將實(shí)驗(yàn)室中的創(chuàng)新轉(zhuǎn)換成產(chǎn)品的問(wèn)題還有待解決，特別是抗體藥物的規(guī)模生產(chǎn)和逡逑質(zhì)量控制技術(shù)目前已成為嚴(yán)重制約我國(guó)抗體產(chǎn)業(yè)發(fā)展的技術(shù)瓶頸。高表達(dá)細(xì)胞系逡逑的建立和高效培養(yǎng)基及培養(yǎng)工藝的開(kāi)發(fā)、高效純化工藝和制劑配方的開(kāi)發(fā)、質(zhì)檢逡逑系統(tǒng)的建立和分析方法的開(kāi)發(fā)等一系列核心技術(shù)是抗體藥物產(chǎn)業(yè)化中亟需解決逡逑的關(guān)鍵技術(shù)，只有提高抗體產(chǎn)量和質(zhì)量并進(jìn)行大規(guī)模的生產(chǎn)，才能將更多的在研逡逑抗體項(xiàng)目從實(shí)驗(yàn)室推向臨床并早日獲得市場(chǎng)準(zhǔn)入，為廣大患者造福。逡逑單克隆抗體藥物由于其特異性強(qiáng)、臨床研究的成功率高于小分子藥物的優(yōu)勢(shì)逡逑
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)院大學(xué)(中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：TQ460.6

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本文編號(hào)：2662053