【摘要】：對(duì)于微生態(tài)制劑的工廠化生產(chǎn),確定重組乳桿菌放大生產(chǎn)最佳的發(fā)酵時(shí)間具有非常重要的意義,一方面可以保證產(chǎn)品質(zhì)量,另一方面可以減少成本。因此,本研究利用傳統(tǒng)的干酪乳桿菌放大培養(yǎng)基MRS培養(yǎng)基對(duì)重組ETEC K99和重組PEDV-S1干酪乳桿菌進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)和發(fā)酵罐生產(chǎn),采用熒光定量PCR檢測(cè)重組質(zhì)粒的拷貝數(shù),利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)目標(biāo)蛋白表達(dá)菌數(shù),探究質(zhì)�？截悢�(shù)與目標(biāo)蛋白表達(dá)菌數(shù)之間的相關(guān)性,確定放大培養(yǎng)的最佳發(fā)酵時(shí)間。首先,通過發(fā)酵重組干酪乳桿菌,繪制重組干酪乳桿菌的生長(zhǎng)曲線,確定其生長(zhǎng)的最佳時(shí)期。之后,將p LA-K99/L.casei與p LA-PEDV-S1/L.casei分別接種至添加抗生素和不添加抗生素的MRS培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng),進(jìn)行穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。我們使用熒光定量PCR方法檢測(cè)重組干酪乳桿菌中質(zhì)粒的拷貝數(shù),使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)乳酸菌的目標(biāo)蛋白表達(dá)菌數(shù)。結(jié)果表明兩株重組菌在搖瓶8 h達(dá)到生長(zhǎng)頂點(diǎn),傳至120代時(shí)外源質(zhì)粒并無丟失情況出現(xiàn)。p LA-K99/L.casei的質(zhì)�？截悢�(shù)在8 h達(dá)到峰值31.12,表達(dá)目標(biāo)蛋白的重組菌在8 h達(dá)到峰值98.64%,p LA-PEDV-S1/L.casei的質(zhì)�？截悢�(shù)在8 h達(dá)到峰值29.97,表達(dá)目標(biāo)蛋白的重組菌在7 h達(dá)到峰值92.76%。兩株重組乳酸菌進(jìn)行200 L發(fā)酵罐放大培養(yǎng)的檢測(cè)結(jié)果表明,與搖瓶發(fā)酵相比,發(fā)酵罐發(fā)酵可以提高細(xì)菌數(shù)量,質(zhì)�？截悢�(shù)及目標(biāo)蛋白表達(dá)菌數(shù)的結(jié)果與搖瓶發(fā)酵結(jié)果一致。以上試驗(yàn)結(jié)果顯示了在細(xì)菌生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期,質(zhì)�？截悢�(shù)和目標(biāo)蛋白表達(dá)菌數(shù)最多。在衰亡期,隨著發(fā)酵時(shí)間的增加,質(zhì)�？截悢�(shù)逐漸減少,目標(biāo)蛋白表達(dá)菌數(shù)也在相應(yīng)減少。因此,重組乳桿菌在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期質(zhì)�？截悢�(shù)與目標(biāo)蛋白表達(dá)量之間存在著正相關(guān)性,發(fā)酵的最佳時(shí)間是6~10 h。重組乳桿菌可以進(jìn)行工廠化發(fā)酵生產(chǎn)。
【圖文】：

狀態(tài)下不發(fā)熒光（見圖 1-1），所以反應(yīng)的初期是檢測(cè)不到熒光信號(hào)的[續(xù)，結(jié)合到 DNA 雙鏈上的染料越來越多，在特定的閾值下就可以檢測(cè)未結(jié)合的染料不會(huì)發(fā)出熒光，所以熒光信號(hào)的增加與 PCR 的擴(kuò)增反應(yīng)是BR Green I 染料的優(yōu)點(diǎn)在于操作方便，通用性好，，應(yīng)用范圍寬泛不受制約的序列設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的引物，并且與探針法相比省時(shí)省力，價(jià)格便宜，方便但是缺點(diǎn)在于它的不特異性，熒光染料可結(jié)合體系中的物質(zhì)，包括 dsDN錯(cuò)誤的產(chǎn)物，造成假陽(yáng)性的結(jié)果幾率大。所以在使用染料做實(shí)驗(yàn)時(shí)，在結(jié)合溶解曲線來分析數(shù)據(jù)的可靠程度，避免實(shí)驗(yàn)過程中的不確定因素，干擾。

圖 1-2 TaqMan 工作原理Figure 1-2 TaqMan working principle測(cè)方面的應(yīng)用菌和霉菌污染室內(nèi)環(huán)境被認(rèn)為是一個(gè)公共健康問題。室內(nèi)空氣了解房屋真菌與呼吸道問題之間聯(lián)系的常用工具。Libert X[50 綠色實(shí)時(shí) PCR 檢測(cè)方法，用于雜色曲霉的特異性檢測(cè)和鑒定環(huán)境中的過敏原。斷方面的應(yīng)用開發(fā)了許多基于熒光探針的實(shí)時(shí) RT-PCR 分析來檢測(cè)病毒。步 SYBR Green I 實(shí)時(shí) RT-PCR 方案檢測(cè) IBV N 基因。Jiang W Green I 的單步定量 qRT-PCR 檢測(cè)方法，以 HTNV 基因組的 S定量。它是一種靈敏，特異，可重復(fù)且簡(jiǎn)單的方法來檢測(cè)定量
【學(xué)位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：TQ920.6

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1 丁滿生;馬文峰;郭美錦;儲(chǔ)炬;張嗣良;龔邦強(qiáng);;溫度誘導(dǎo)模式對(duì)重組大腸桿菌質(zhì)粒拷貝數(shù)的影響[J];華東理工大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2006年01期

2 王劍;夏杰;陸兵;徐殿勝;;培養(yǎng)基組分對(duì)hCG核酸疫苗質(zhì)�？截悢�(shù)的影響[J];化學(xué)與生物工程;2009年05期

本文編號(hào)：2654084