【摘要】：對于微生態(tài)制劑的工廠化生產(chǎn),確定重組乳桿菌放大生產(chǎn)最佳的發(fā)酵時間具有非常重要的意義,一方面可以保證產(chǎn)品質(zhì)量,另一方面可以減少成本。因此,本研究利用傳統(tǒng)的干酪乳桿菌放大培養(yǎng)基MRS培養(yǎng)基對重組ETEC K99和重組PEDV-S1干酪乳桿菌進行搖瓶培養(yǎng)和發(fā)酵罐生產(chǎn),采用熒光定量PCR檢測重組質(zhì)粒的拷貝數(shù),利用流式細胞術檢測目標蛋白表達菌數(shù),探究質(zhì)�？截悢�(shù)與目標蛋白表達菌數(shù)之間的相關性,確定放大培養(yǎng)的最佳發(fā)酵時間。首先,通過發(fā)酵重組干酪乳桿菌,繪制重組干酪乳桿菌的生長曲線,確定其生長的最佳時期。之后,將p LA-K99/L.casei與p LA-PEDV-S1/L.casei分別接種至添加抗生素和不添加抗生素的MRS培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng),進行穩(wěn)定性實驗。我們使用熒光定量PCR方法檢測重組干酪乳桿菌中質(zhì)粒的拷貝數(shù),使用流式細胞術檢測乳酸菌的目標蛋白表達菌數(shù)。結果表明兩株重組菌在搖瓶8 h達到生長頂點,傳至120代時外源質(zhì)粒并無丟失情況出現(xiàn)。p LA-K99/L.casei的質(zhì)�？截悢�(shù)在8 h達到峰值31.12,表達目標蛋白的重組菌在8 h達到峰值98.64%,p LA-PEDV-S1/L.casei的質(zhì)粒拷貝數(shù)在8 h達到峰值29.97,表達目標蛋白的重組菌在7 h達到峰值92.76%。兩株重組乳酸菌進行200 L發(fā)酵罐放大培養(yǎng)的檢測結果表明,與搖瓶發(fā)酵相比,發(fā)酵罐發(fā)酵可以提高細菌數(shù)量,質(zhì)粒拷貝數(shù)及目標蛋白表達菌數(shù)的結果與搖瓶發(fā)酵結果一致。以上試驗結果顯示了在細菌生長的對數(shù)生長期末期,質(zhì)�？截悢�(shù)和目標蛋白表達菌數(shù)最多。在衰亡期,隨著發(fā)酵時間的增加,質(zhì)粒拷貝數(shù)逐漸減少,目標蛋白表達菌數(shù)也在相應減少。因此,重組乳桿菌在對數(shù)生長期質(zhì)粒拷貝數(shù)與目標蛋白表達量之間存在著正相關性,發(fā)酵的最佳時間是6~10 h。重組乳桿菌可以進行工廠化發(fā)酵生產(chǎn)。
【圖文】：

狀態(tài)下不發(fā)熒光（見圖 1-1），所以反應的初期是檢測不到熒光信號的[續(xù)，結合到 DNA 雙鏈上的染料越來越多，在特定的閾值下就可以檢測未結合的染料不會發(fā)出熒光，所以熒光信號的增加與 PCR 的擴增反應是BR Green I 染料的優(yōu)點在于操作方便，通用性好，，應用范圍寬泛不受制約的序列設計對應的引物，并且與探針法相比省時省力，價格便宜，方便但是缺點在于它的不特異性，熒光染料可結合體系中的物質(zhì)，包括 dsDN錯誤的產(chǎn)物，造成假陽性的結果幾率大。所以在使用染料做實驗時，在結合溶解曲線來分析數(shù)據(jù)的可靠程度，避免實驗過程中的不確定因素，干擾。

圖 1-2 TaqMan 工作原理Figure 1-2 TaqMan working principle測方面的應用菌和霉菌污染室內(nèi)環(huán)境被認為是一個公共健康問題。室內(nèi)空氣了解房屋真菌與呼吸道問題之間聯(lián)系的常用工具。Libert X[50 綠色實時 PCR 檢測方法，用于雜色曲霉的特異性檢測和鑒定環(huán)境中的過敏原。斷方面的應用開發(fā)了許多基于熒光探針的實時 RT-PCR 分析來檢測病毒。步 SYBR Green I 實時 RT-PCR 方案檢測 IBV N 基因。Jiang W Green I 的單步定量 qRT-PCR 檢測方法，以 HTNV 基因組的 S定量。它是一種靈敏，特異，可重復且簡單的方法來檢測定量
【學位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：TQ920.6

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本文編號：2654084