【摘要】：核桃粕是核桃仁經(jīng)壓榨后的廢棄物,常被作為飼料使用,附加值低。核桃粕蛋白質(zhì)含量較高,利用核桃粕開發(fā)具有較高生物活性的深加工產(chǎn)品,具有十分重要的意義。本論文以核桃粕為原料,篩選特定的蛋白酶對核桃蛋白進行水解,獲得具有抑菌功能的抗菌肽,對抗菌肽分離純化,獲得氨基酸序列及來源蛋白質(zhì)等信息,在此基礎上,對抗菌肽的抑菌穩(wěn)定性及抑菌機理進行初步探討,具體實驗內(nèi)容及實驗結果如下:1.優(yōu)化核桃抗菌肽制備工藝以酶解液的抑菌活性為評價指標,篩選適宜的蛋白酶作為酶解核桃蛋白的最優(yōu)蛋白酶。研究結果顯示:胃蛋白酶水解核桃蛋白得到的多肽,對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌的生長具有一定的抑制作用�；谏鲜鲅芯�,以水解度為評價指標,采用響應面試驗設計優(yōu)化胃蛋白酶酶解核桃蛋白最佳工藝條件。結果顯示:溫度為54.11℃,pH為3.46,加酶量為5475.71U/g,水解度最優(yōu),可達13.99%。2.核桃抗菌肽分離純化將得到的酶解液按分子量大小(3KDa、10KDa、30KDa)進行超濾處理,對不同分子量大小的多肽抑菌活性進行測定,篩選出分子量在3-10KDa范圍的多肽(H-II)抑菌活性較優(yōu),采用反相高效液相色譜法對該分子量范圍的多肽進行分離純化,得到7種具有抑菌活性的多肽組分(H-II-1～H-II-7),其中組分H-II-6抑菌效果最優(yōu),對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌均有顯著的抑制作用。3.抗菌肽H-II-6氨基酸序列研究利用基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)、四極桿-軌道阱液質(zhì)聯(lián)用(QE-MS)技術及Sprot數(shù)據(jù)庫提供的植物源抗菌肽序列信息,研究抗菌肽H-II-6分子量及氨基酸序列信息。研究結果表明:H-II-6抗菌肽的分子量為3772.7359Da,序列推測為 Thr-Gly-Ger-Gla-Val-Pro-Ger-Pro-Arg-Gla-Ger-Gla-Thr-GlaThr-Met-Glu-Met-Gla-G la-Gla-M et-Gly-Leu-M et-Pro-Gly-G er-Pro-G er-G er-Val-Ger-Gla-Val-Met-Ger-Pro-Phe,疏水性氨基酸有脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和纈氨酸,約占氨基酸總數(shù)的50%,長度為39個氨基酸,所屬蛋白質(zhì)的序列編號為Q10EL1。4.H-II-6抗菌肽抑菌穩(wěn)定性及機理初探研究了H-II-6抗菌肽在紫外照射、不同pH、不同溫度條件下的抑菌穩(wěn)定性,同時從菌體細胞形態(tài)方面探討了H-II-6抗菌肽對三種細菌的作用機制。研究結果表明:pH在5.0-9.0范圍內(nèi),隨pH的增大,H-II-6抗菌肽的抑菌活性降低,抑菌圈直徑差異顯著(p0.05);在40-121℃溫度范圍,H-II-6抗菌肽的抑菌活性變化差異不顯著(p0.05);紫外線照射1h內(nèi),組分H-II-6對菌株的抑制作用變化不顯著(p0.05)。因此,H-II-6抗菌肽對紫外線和溫度具有較好的抑菌穩(wěn)定性。H-II-6抗菌肽可以使金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的菌體細胞發(fā)生不同程度的表面凹陷、斷裂以及細胞破碎,從而實現(xiàn)對細菌生長的抑制作用。
【圖文】：

選取底物濃度３ｇ／１００ｍＬ，邋ｐＨ值３．０，溫度５０°Ｃ，酶解時間４ｈ，以水解度為評價逡逑指標，分別在３０００Ｕ／ｇ、４０００Ｕ／ｇ、５０００Ｕ／ｇ、６０００Ｕ／ｇ的條件下對核桃蛋白進行酶解逡逑實驗，加酶量與水解度的變化情況如圖２－１所示。逡逑１４邋－邐ｄ逡逑，，２．邐Ａ＾逡逑／逡逑一邋１０邋－邋／逡逑ｔ邐／逡逑＾邋８－邐ｙ逡逑％逡逑？邋６－邋／逡逑４邋－邋Ｙ逡逑３０００邋３５００邋４０００邋４５００邋５０００邋５５００邋６０００逡逑加酶量⑴／ｇｊ逡逑圖２－１加酶量對水解度影響逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ邋ｏｎ邋ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ邋ｗｉｔｈ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｅｎｚｙｍｅ邋ａｄｄｉｔｉｏｎ逡逑由圖２－１可知，當加酶量在３０００－５０００Ｕ／ｇ時，水解度隨著酶添加量的增加而提逡逑１５逡逑

選�。穑戎禐椋常埃瑴囟龋担�°Ｃ，酶解時間４ｈ，酶濃度５０００Ｕ／ｇ，以水解度為評價逡逑指標，分別在２ｇ／１００ｍＬ、３ｇ／１００ｍＬ、４ｇ／１００ｍＬ、５ｇ／１００ｍＬ的條件下對核桃蛋白進逡逑行酶解，底物濃度與水解度的變化情況如圖２－２。逡逑１４邋－逡逑１２邋－邐Ｊ邐ｃ逡逑１０邋－逡逑２邋８－逡逑鹋／逡逑Ｒ４ｒ邋６邋－逡逑芩４：逡逑２邋－逡逑0邋２．０邐２．５邐３．０邐３．５邐４．０邐４．５邐５．０逡逑底物濃度（％）逡逑圖２－２底物濃度對水解度影響逡逑Ｆｉｇ．邋２－２Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ邋ｏｎ邋ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ邋ｗｉｔｈ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｓｕｂｓｔｒａｔｅ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ逡逑由圖２－２可知，當?shù)孜餄舛仍冢玻ィ常r，隨著底物濃度的增大，水解度增大，但逡逑整體上升趨勢平穩(wěn)，當再增大底物濃度時，水解度開始下降。底物濃度較低時，自由逡逑水含量較多，有利于分子在溶液中擴散，酶與底物結合幾率較大，水解度升高，而高逡逑濃度的核桃蛋白會對酶形成抑制作用；并且考慮低碳經(jīng)濟，提高效率；因此，確定核逡逑桃蛋白的底物濃度為３％。逡逑２．４Ａ３邋ｐＨ的影響逡逑選取酶解溫度５０°Ｃ，提取時間４ｈ，酶濃度５０００Ｕ／ｇ，底物濃度３ｇ／１００ｍＬ，以水逡逑解度為評價指標，分別在ｐＨ２．０、ｐＨ３．０、ｐＨ４．０、ｐＨ５．０的條件下對核桃蛋白進行酶逡逑解，ｐＨ與水解度的變化情況如圖２－３。逡逑１６逡逑
【學位授予單位】：北京林業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：TS202.3;TS229

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