【摘要】：L-2-氨基丁酸(L-ABA)是一種非天然手性氨基酸,在醫(yī)藥、化工領域都有廣泛的應用。L-ABA的合成方法主要有化學法和生物法,其中以亮氨酸脫氫酶合成L-ABA的體系具有轉化效率高、無副產物以及產物易分離等優(yōu)點,在工業(yè)化生產上具有很大應用前景。亮氨酸脫氫酶合成L-ABA的體系是以L-蘇氨酸為底物,先經蘇氨酸脫氨酶脫氨生成α-酮丁酸,再利用亮氨酸脫氫酶將酮酸還原為L-ABA,同時還原反應所消耗的NADH通過甲酸脫氫酶再生。但是,在該生產體系中存在輔酶消耗量過大的問題,即反應過程中需再添加輔酶。針對此現(xiàn)狀,本文通過在嗜溫表達宿主EscherichiacoliBL21(DE3)中表達熱穩(wěn)定蛋白,再對重組細胞熱處理以消除宿主蛋白對L-A B A合成的影響。使體系中輔酶的損耗降低,從而降低輔酶的需求量,為大規(guī)模工業(yè)生產L-ABA提供了更大的可能。同時,也為有輔酶參與的工業(yè)生物催化路徑提供了一定參考。本文首先在嗜溫通用表達宿主E.coliBL21(DE3)中分別表達Escherichiacoli K12來源的蘇氨酸脫氨酶(L-TD),熱穩(wěn)定的Bacillus sphaericus DSM730來源的亮氨酸脫氫酶(L-LeuDH)及Candida boidinii來源的甲酸脫氫酶(FDH)。針對野生型L-TD的熱穩(wěn)定性差而無法滿足熱處理的問題,故對其進行穩(wěn)定性改造。首先設計了針對L-TD的高通量篩選方法,并利用易錯PCR構建具有穩(wěn)定突變率的突變體庫。通過篩選,得到了三株陽性突變株:A14T、T344A和R449C,其在42℃下的半衰期(t1/2,42℃)從野生型的10min分別延長到14min,19 min和15 min。T5015(酶在該溫度下15 min內喪失50%的活力)則由39。C分別提高到41 ℃,42 ℃和41.2 ℃。為獲得更多的陽性突變株,利用多重序列比對結合計算機模擬的方法選出可能與L-TD的穩(wěn)定性相關的氨基酸殘基,再通過定點飽和突變進行驗證。最終篩選到兩株陽性突變株G323D和F510L,其t1/2,42℃分別從野生型的10min延長到57min和44min,T TV5則分別提高到46.2℃和44.8℃。以穩(wěn)定性提高最明顯的突變株G323D為模板,分別與A14T,T344A,R449C及F510L進行組合突變。其中組合突變株G323D/F510L的穩(wěn)定性提高最明顯,共t1/2,42℃延長至201min,T5T15提高到52.5℃。再以G323D/F510L為模板,分別與T344A,R449C,T344A/R449C進行組合突變,其中組合突變株G323D/F510L/T344A的熱穩(wěn)定性最優(yōu),其t1/2,42℃和T5015分別為210min和53℃。探究了 L-ABA催化體系中FDH酶活和輔酶添加量對L-ABA合成的影響,發(fā)現(xiàn)體系中FDH與輔酶的添加量對L-ABA產率影響都很大。通過測定在50 ℃下不同熱處理時長的宿主E.coli BL21(DE3)蛋白對NADH的影響,發(fā)現(xiàn)50℃熱處理1h能有效的解除宿主蛋白對NADH的降解,即此時宿主蛋白對體系中NADH的濃度影響很小。最后,對比改進后體系(經熱處理的G323D/F510L/T344A、L-LeuDH、FDH)與原始體系(野生型 L-TD、L-LeuDH、FDH),改進后體系在較低的NAD+添加量(0.04 g/L)時,L-ABA的摩爾轉化率可達到99%,而原始體系的摩爾轉化率只有65.3%。
【圖文】：

士學位論文邐逡逑第一章緒論逡逑基丁酸是一種非蛋白質氨基酸，少量存在于動、植物的組織器官中。有一個手性碳原子，故有兩種旋光異構體，即Ｌ（＋）－２－氨基丁酸和Ｄ（＋酸（圖邋１．１邋）。其中邋Ｌ（＋）－２－氨基丁酸（Ｌ－２－ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ邋ａｃｉｄ，邋Ｌ－ＡＢＡ），４Ｈ９ＮＯ２，分子量為邋１０３．１１９８，ＣＡＳ邋號：１４９２－２４－６，熔點：２９８－３０４邋°ＣｍＨｇ壓力下沸點為２１５＿２°Ｃ，，閃點８３．９°Ｃ，相對密度為１．１０５，水溶（２２。（：），比旋光度［？］＾）為２丨．６。，；２５。＜：的蒸汽壓為邋０．０５７９１１１１１１１＾。逡逑ＯＨＯＨ逡逑

士學位論文用Ｄ－氛基酸氧化酶選擇性氧化Ｄ－２－氨基丁酸，將外消旋Ｄ拆分從而獲得Ｌ－ＡＢＡ，收率可達到８５邋％邋［１＼逡逑合成法逡逑酵法逡逑Ｌ－蘇氨酸重組￡．邋ｃｏ／／為出發(fā)菌株，通過重組表達／／以和ＢＡ工程菌，并通過分批補料發(fā)酵最終Ｌ－ＡＢＡ可以積累１９ｇ／Ｌ，１１．６３邋％，合成途徑如圖ｌｊ１１』。通過在ｃｅ７，ｅｖ／ｓＤ及谷氨酸脫氫酶，以Ｌ－蘇氨酸為底物發(fā)酵生產（Ｓ）－２－氨基丁邋ｍｇ／Ｌ丨１２丨。逡逑Ｇｌｕｃｏｓｅ逡逑
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：TQ921

【參考文獻】

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1 徐紅梅;夏仕文;何從林;;固定化D-氨基酸氧化酶催化DL-氨基酸去消旋化制備非天然L-氨基酸[J];分子催化;2012年02期

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本文編號：2632577