【摘要】：海藻糖是由兩個(gè)葡萄糖分子通過α-1,1糖苷鍵連接而成二糖,有非還原性末端,并且有較強(qiáng)的生物活性,在食品醫(yī)藥領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。海藻糖合酶只需一步反應(yīng)就能將麥芽糖轉(zhuǎn)化為海藻糖,反應(yīng)在低溫下即可進(jìn)行,成本較低。本研究通過改造來源于惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida P06)的海藻糖合酶(Trehalose synthase,TreS),提升反應(yīng)轉(zhuǎn)化率,并在畢赤酵母中進(jìn)行分泌表達(dá),具體研究成果如下:(1)利用I-TASSER在線服務(wù)器進(jìn)行TreS的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),利用AUTODOCK進(jìn)行底物與酶的對(duì)接,通過分析酶-底物復(fù)合體,選擇了距離底物結(jié)合區(qū)域4~8?范圍的氨基酸。將TreS利用NCBI進(jìn)行Blast分析,構(gòu)建一個(gè)500種海藻糖合酶的序列比對(duì)庫。分析4~8?范圍氨基酸殘基的保守性,排除高度保守序列,最終選擇了位于催化口袋上方的232位天冬氨酸、底物進(jìn)出通道的407位纈氨酸以及位于口袋底部的490位賴氨酸。設(shè)計(jì)飽和突變引物,以質(zhì)粒pET-15b-tres為模板,構(gòu)建突變體庫,經(jīng)過篩選驗(yàn)證獲得三株轉(zhuǎn)化率提高的突變酶(V407M、K490L、V407M/K490L),其轉(zhuǎn)化率分別提高了7.2%、9%及11.9%。酶學(xué)性質(zhì)分析表明,V407M/K490L的熱穩(wěn)定性及耐酸性都得到增強(qiáng),反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)證明,突變對(duì)其底物結(jié)合能力和催化效率都起到積極影響。(2)將得到的突變酶(tres3)利用分子生物學(xué)手段,連接至畢赤酵母表達(dá)載體pGAP-ZαA,構(gòu)建重組表達(dá)載體pGAP-ZαA-tres3,利用電轉(zhuǎn)化整合到畢赤酵母GS115中。通過陽性驗(yàn)證及高拷貝篩選,得到重組畢赤酵母GS115/pGAP-ZαA-tres3,搖瓶發(fā)酵結(jié)果表明,重組菌胞內(nèi)酶活力最高為120U/g。(3)對(duì)構(gòu)建的重組畢赤酵母GS115/pGAP-ZαA-tres3進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的優(yōu)化,搖瓶條件下以優(yōu)化的培養(yǎng)基及發(fā)酵條件,重組菌胞內(nèi)酶活力提升了35%。以優(yōu)化后的培養(yǎng)基進(jìn)行重組酵母的高密度發(fā)酵,通過流加葡萄糖的方式控制菌體生長代謝速率,發(fā)酵結(jié)果顯示胞內(nèi)最高酶活力為695U/g,胞外酶活力最高為29.3U/mL。
【圖文】：

第 1 章 緒論與性質(zhì)se）最早是 1832 年由Wiggers在黑麥的麥角無脊椎動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)海藻糖[1,2]。隨著研究海藻糖，例如植物中的擬南芥和卷柏，微生類中都有存在[3,4,5]。在大腸桿菌（Escheric分歧桿菌（Mycobacteria）、脂肪桿菌（Pim海藻糖的存在，證明了海藻糖是自然環(huán)境中學(xué)結(jié)構(gòu)由Bredereck通過核磁共振技術(shù)發(fā)現(xiàn)苷鍵連接而構(gòu)成的具有非還原性末端構(gòu)式為：

圖 2.1 全質(zhì)粒 PCR 飽和突變?cè)鞦ig2.1 The schematic of the mutagenesis of Full- plasmid PCR實(shí)驗(yàn)所用引物利用 Oligo7.0 軟件設(shè)計(jì)，引物由上海生工生物負(fù)責(zé)合成。引物序列如表 2.5 所示：其中下劃線代表飽和突變位點(diǎn)。表 2.5 飽和突變引物Table2.5 Saturation Mutation PrimersPrimer name Primer sequence（5'-3'）ASP232-FASP232-RVAL407-FVAL407-RGGCGTGAAGGAAACCNNKTGGAGCGCCACGCCGCGGCGTGGCGCTCCAMNNGGTTTCCTTCACGCCAACCATGACGAGCTGACCNNKGAGCTGGTGCACTTCTGGCCAGAAGTGCACCAGCTCMNNGGTCAGCTCGTCATGGTTLYS490-F AGCGGATATCGAACTGATCNNKAAGGTGCACCTGCTGCTGGLYS490-R CCAGCAGCAGGTGCACCTTMNNGATCAGTTCGATATCCGCT以提取自 E.coli DH5α的 pET-15b-tres 質(zhì)粒為模板，，以表 2.5 中的引物為擴(kuò)增引物，利用 2×Phanta Max Master Mix 高保真聚合酶進(jìn)行突變質(zhì)粒擴(kuò)增，其中
【學(xué)位授予單位】：齊魯工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：Q55;TQ920.6

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2632502